CUT&Tag 기술은 항체로 표지된 chromatin이 Tn5 transpose와 Protein AG에 의해 선택적으로 절단되고 시퀀싱 어댑터가 태깅되면서 반응 혼합물에서 직접 증폭되어 (Direct-to-PCR) 라이브러리 필요없이 높은 민감도로 크로마틴 시퀀싱을 진행할 수 있는 방법으로, PTM 매핑에 권장됩니다.  EpiCypher의 CUT&Tag Kit은 세포에서 정제된 시퀀싱 라이브러리 준비에 필요한 모든 시약을 제공합니다. 최근 출시된 Version 2 제품은 프로토콜과 버퍼구성을 최적화하여 샘플 소실을 최소화합니다.  CUT&Tag이 왜 필요한가요? 기존의 ChIP 기술로는 불가능한 단순화된 workflow가 필요할 때, High throughput 크로마틴 매핑 분석이 필요할 때, 세포수가 적을 때, 더 높은 해상도의 데이터가 필요할 때 유용합니다.  CUT&Tag이 ChIP-seq이나 CUT&RUN에 비해 훨씬 빠른 이유는 무엇인가요? 세포 용해, 염색질 단편화 과정 없이 천연 세포에서 15분 안에 핵을 수확하여 자성 ConA 비드와 자석 랙을 통해 신속하게 세척과정을 수행할 수 있고, 시퀀싱 어댑터를 직접 추가함으로써 표준 라이브러리를 만들 필요가 없어 샘플 손실이 줄어듭니다. 8 strip tube에서 PCR mix와 indexing primer, tagmented DNA를 바로 증폭할 수 있어 시간이 단축되므로, 시간에 민감한 프로젝트의 경우 효과적입니다. ChIP-seq에 비해 CUT&Tag에서 더 적은 수의 셀을 사용할 수 있는 이유는 무엇인가요? ChIP-seq에서는 input 염색질을 준비하려면 cross-linking, chromatin sonication 이나 fragmentation이 필요하고, IP 단계에서 단편화된 염색질 pool에 항체가 추가됩니다. 항체가 표적에만 결합해야 하지만 IP 방법은 항상 off-target fragment를 생성하여, 시퀀싱에서 높은 백그라운드와

CUT&RUN이란? CUT&RUN은 Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease를 의미합니다. Lectin 단백질로 코팅된 magnetic ConA bead는 세포막이나 핵의 막에서 발견되는 당접합체(glycoconjugates)를 결합하는데 사용됩니다. 타겟(예, PTM)에 대한 항체는 막을 통과하여 타겟 염색질에 붙습니다. 다음으로 Protein AG micrococcal nuclease (pAG-MNase)가 첨가되는데, 이는 항체 결합 염색질에 결합합니다. 염화칼슘을 첨가하면 효소의 표적 복합제 절단이 활성화되어 세포밖으로 확산될 수 있습니다.  DNA는 상층액에서 수집되어 library 준비 전에 정제됩니다. 실험의 성공여부는 시퀀싱 코어 또는 벤치탑 sequencer를 사용하여 시퀀싱하기 전에 바이오분석기 추적을 통해 테스트됩니다. 결과가 나오면 통합 genome 브라우저 또는 적절한 시각화 도구를 사용하여 데이터를 분석하고 볼수 있습니다. EpiCypher의 CUT&RUN 프로토콜은 히스톤 PTMs, 전사 인자, 염색질 리모델러, Writer 및 Reader의 게놈 프로파일링을 위한 검증된 플랫폼을 제공합니다. 세포 타입 및 조건 CUT&RUN을 처음 사용하거나, 새로운 항체를 테스트하는 경우, 세포유형, 실험조건, 대조 및 항체를 신중하게 고려하는 것이 중요합니다. EpiCypher의 CUT&RUN 프로토콜은 다양한 세포 및 샘플 유형과 호환됩니다.  Histone PTMs 및 transcription factor를 프로파일링하는 경우, 부착 세포와 현탁 세포주, 조직 샘플 등, native cell 또는 고정되지 않은 세포가 이상적입니다. CUTANA CUT&RUN 프로토콜은 약하게 cross-linking된 cell에도 사용할 수 있습니다. 일시적인 염색질 상호작용과 histone PTMs의 특정 하위 집합을 프로파일링 하려면 샘플을 고정하는 것을 권장

감마 델타(γδ) T 세포는 기존의 α 및 β TCR 사슬 대신 고유한 γ 및 δ TCR(T 세포 수용체) 사슬을 발현하는 작은 T 세포 하위 집합입니다. γδ T 세포는 장, 폐 및 생식관과 같은 말초 혈액 및 점막 상피 조직에 존재합니다. MHC 분자에 의해 제시된 항원성 펩타이드를 인식하는 기존의 αβ T 세포와 달리, γδ T 세포는 많은 병원체에서 발견되는 단백질 및 심지어 phosphoantigen까지도 직접 인식합니다. γδ T 세포는 자연 살해(NK) 세포와 유사한 특징을 가지므로 종종 "선천적 T 세포"로 표현됩니다. γδ T 세포는 IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-17과 같은 사이토카인의 생산 및 분비를 포함하여 많은 기능을 수행합니다. γδ T 세포는 많은 감염 및 질병 모델에서 전염증성 (proinflammatory) 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α의 중요한 초기 공급원입니다. NK 세포와 유사하게 γδ T 세포는 FcR 매개 ADCC(항체 의존성 세포 독성), Fas-FasL 및 TRAIL ligation 뿐만 아니라 세포 독성 Perforin 및 Granzyme 작용을 통해 세포 살상을 수행합니다. 또한, γδ T 세포는 항종양 효과를 나타내는 자가반응성 IgE로의 B 세포 클래스 전환을 유도하고, αβ T priming을 돕는 항원 제시 세포 역할을 하며, 수지상 세포(DC) 성숙을 유발하고, NK 세포 활성을 향상시킵니다. 종양 세포는 MICA/B shedding, 이종 항원 및 낮은 항원 확산을 통해 면역 체계를 회피합니다. MHC 비의존성 γδ T 세포는 광범위한 항원 특이성, NK 유사 세포독성 및 항체 분비, αβ T 세포 프라이밍 및 DC 성숙과 같은 항종양 효과의 활성화를 통해 종양면역에 적합하여 암 면역치료 요법에서 새로운 전략이 됩니다.  대부분의 인간 γδ T 세포는 항종양 기능을 가지고 있지만, 그들은 또한 전종양 (pro-tumor) 특성을 갖는 것으로 보고되었습니다. 두 가지 주

DNA, RNA 및 단백질등의 바이오마커는 기본 세포 기능을 이해하고 임상 질환을 진단하며 최적의 치료법을 식별하기 위한 강력한 도구입니다. 특히, RNA는 유기체에서 발생하는 동적 유전자 발현 변화를 확인하는 이상적인 지표입니다.  ACD사에서는 손상되지 않은 조직 내 단일 세포 수준의 in situ 유전자 발현을 포착하는 ISH 분석서비스를 제공합니다. 이 방법은 세포 간 상호 작용을 더 잘 이해하기 위해 형태학적 맥락에서 분자를 검출합니다.  RNAscope ISH 분석은 특허받은 신호 증폭 및 백그라운드 신호 억제 기술을 기반으로 하며 기존 RNA ISH에 비해 특이성과 민감도가 크게 향상됩니다. 가장 대표적인 RNAscope ISH 분석 사례를 소개합니다. 1. Single Cell Analysis 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-Seq)으로 개별 세포의 전사체 프로필을 특성화하는 것은 알려진 세포 유형과 새로운 세포 유형을 식별하고 조직 구조와 기능을 이해하는 보편적인 도구가 되어 단일 세포 생물학의 새로운 시대를 열었습니다. 이는 특히 포유류 뇌 및 종양과 같이 세포 이질성이 높은 복잡한 기관 및 조직에서 사실임이 입증되었습니다. 그러나 scRNA-Seq는 분리된 세포를 활용하므로 분석 중인 세포 집단의 공간 조직이 손실됩니다. 따라서 단일 세포 및 공간적 유전자 발현 모두를 시각적으로 확인하기 위해 RNA in situ hybridization(ISH)과 같은 방법으로 scRNA-seq 분석을 보완하는 것이 필수적입니다. RNAscope Assay는 강력하고 특이성이 높으며 민감한 멀티플렉스 RNA ISH assay로, 높은 처리량의 단일 세포 전사체 결과를 시각화할 수 있습니다. 단일 세포 수준에서 최대 4개의 특정 마커를 이용하여 최대 4개의 다중분석을 수행할 수 있습니다 (IHC와 결합 가능). 이러한 분석을 통해 단일 세포 내의 개별 유전자 및 유전자 시그니처 발현 프로필을 시각적으로 확인할 수 있으므로 전사 결과를 검증할 수 있습니다

Eurofins Discovery사에서 제공하는 항체치료제  evaluation 적용사례를 소개합니다.  이 사례에서는 안전성 프로필을 갖춘 시판 의약품인 Trastuzumab (Herceptin)을 이용하여, 약물 개발 및 승인 프로세스의 목표, 대상을 검증하고 최적화 하기 위해 주요하게 필요한 항목과 데이터는 무엇인지, 전임상으로 가기 위한 데이터화 과정 등을 소개합니다.  Trastuzumab은? Herceptin이라고도 불리며, ErbB2를 타겟으로 하는 humanized monoclonal anitbody입니다. HER2 양성 유방암 치료제로 1998년에 FDA 승인을, 2000년에는 EMA 승인을 받았고, 2010년에는 HER2 양성 위암 치료제로 FDA 허가를 받았습니다. 초기 바이오치료제로서 2019년에 67억 달러를 초과한 매출로 임상적 유용성이 입증되었습니다. 이후 생물학적 제제의 승인은 가속화되고 있고, FDA는 48개의 mAbs를 승인했습니다. 또한 바이오시밀러에 대한 승인도 증가하여, 2017년부터 FDA 승인을 받은 Trastuzumab용 바이오시밀러는 Ogivri®, Herzuma®, Ontruzant®, Trazimera™, Kanjinti™등이 있습니다.  Eurofins Discovery의 trastuzumab 평가를 위한 실험 디자인 trastuzumab의 평가를 위해 2개의 파트로 나누어 실험을 진행하였습니다.  파트 1 :  trastuzumab의 포괄적인 특성화를 제공하는 분자적 접근방식  SPR (Surface Plasmon Resonance)를 이용한 Fc receptor binding assay : FcRn 및 FcgammaRI와 trastuzumab과의 binding affinity 확인 Receptor binding과 receptor occupancy (RO) assay : BT-474 cell에서 trastuzumab의 antibody binding capacity (ABC)를 평가하고 HER2-PE 항체를

ChIP-seq을 진행하고 계시나요?   차세대 크로마틴 매핑 기술인 CUT&RUN과 CUT&Tag에 대해 들어보셨는지요?  EpiCypher에서는 실험실 경험을 바탕으로 최상의 크로마틴 매핑 분석법을 선택하는 3가지 Key point를 안내해 드립니다.  Key Point 1:  일단 ChIP-seq으로 부터 벗어나자! 전통적으로 이용되어 오고 있는 ChIP-seq 방법은 다음과 같은 단점이 있습니다.  수백만 개의 세포 필요 - 희귀한 세포, 혹은 임상 샘플 프로파일링시 제한적입니다. 최적화를 위해 기술적으로 어려운 실험 과정 필요 - cross-linking, chromatin fragmentation, immunoprecipitation 과정을 거치는 동안 노이즈와 sequencing artifact문제가 발생합니다. 시간이 많이 걸리는 프로토콜 - 세포에서 시퀀서에 로딩하는 데 까지 최대 1주일을 소비해야 합니다.  높은 시퀀싱 depth 필요 - ChIP은 백그라운드에서 충분한 신호를 보내기 위해 일반적으로 library당 20-40M의 read가 필요합니다.  낮은 데이터 품질 및 신뢰성 - 백그라운드가 높고, 수율은 낮습니다.    낮은 처리량 - 대규모 분석이 어려워 시간이 많이 소요되고 시퀀싱 비용이 높습니다. 그럼에도 불구하고 ChIP-seq은 수십년 동안 사용되어 온 최고의 크로마틴 매핑 기술이었습니다. 그러나 최근에는 CUTANA CUT&RUN 및 CUT&Tag 분석을 통해 이런 문제가 해결되었습니다. Figure 1: ChIP-seq fails the major requirements for chromatin mapping assays, but historically was the best option available. CUTANA™ CUT&RUN and CUT&Tag assays provide a new approach for high-resolution chromatin profili

TopoGEN은 Topoisomerase 표적 약물을 식별하기 위한 스크리닝 서비스를 제공합니다.  Topoisomerase drug은 두가지 메카니즘에 관여합니다.  1. 효소의 활성 억제 (Catalytic Inhibitory Compound, CICs) 이러한 약물은 효소의 촉매 활성을 차단하거나 제한합니다. 일반적으로 CIC는 전체 반응 순서 중 1단계 또는 2단계에서 작용합니다. cleavage complex로 진행하는데 필요한 non-covalent complex를 막아 촉매를 효과적으로 차단합니다. Top2 CIC (ICRF-187) 종류가 많은 반면 Top1 CIC는 적습니다. NaCl의 증가가 CIC를 모방할 수 있기 때문에 CIC는 비특이적으로 반응할 수 있습니다. 혹은 강한 DNA intercalator가 촉매 반응 순서를 방해할 수 있습니다.  2. Cleavable complex 형성 촉진 (Interfacial Poisons, IFPS) 이러한 약물들은 re-ligation step을 묶어버림으로써 효소가 DNA target sequence에 공유적으로 포획되고, 동시에 절단된 DNA가 안정화되도록 합니다. IFP는 cleavage complex에 입체 화학적으로 개입하여 IFP 제재가 절단 중간산물의 정렬 오류를 유도하여 cleavage complex를 다시 정렬할 수 없도록 하는 topo+drug+DNA를 형성하는 것으로 보입니다.  IFP를 테스트할 때 proteinase K digestion 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 cleavage product가 agarose gel에서 shift되어 해석이 불가능해 집니다.   Topoisomerase I reaction scheme Step 1 : Topoisomerase I (Top1)이 template를 스캔하고 binding 할 수 있는 위치를 찾아낸다.   Step 2 : 일단 적합한 위치를 찾게 되면, enzyme은 ionic/electrostatic int

중개연구 (Translational Research)는 기초연구에서 발견된 실험 성과를 임상에 응용하기 위해 신약과 치료제를 검증하기 위한 과정입니다.  표현형 프로파일링 및 환자유래 질병 및 정상인 세포를 이용한 in vitro 스크리닝을 통해 다중 표적 및 경로 메커니즘의 활성을 검증할 수 있습니다.  Translational Cell Models (TCM)  1. Human 3D PKD Cystogenesis Assays  상염색체 우성 다낭성 신장 질환 (Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease, ADPKD)은 PKD1 유전자 (polycystin 1) 또는 PKD2 gene (polycystin 2)의 돌연변이에 의해 유발되어 천천히 진행되는 유전적 신장질환 입니다. 두가지 형태의 PKD는 양쪽 신장에 체액으로 채워진 낭종이 형성되어 결국 말기 신장 질환으로 이어집니다. PKD의 여러 in vivo 및 in vitro 모델이 존재하지만, 대부분이 인간 질병 표현형을 완전히 모사하지 못하여 human clinical trial에서 대부분 실패를 경험합니다.  Eurofins의 PKD 모델은, 생식선 돌연변이가 결정되는 인간 PKD 기증자 신장의 개별 낭종에서 분리된 세포를 활용하여 개발된 384웰 조직 배양 형식의 고유한 3D PKD 낭종 분석 플랫폼입니다. 배양 후, 낭종이 형성되면 알고리즘 기반 이미지 분석을 통해 정량화된 낭종 크기 및 수를 사용하여 고함량 이미징으로 추적합니다. 이 플랫폼은 후보 약물의 고처리량 스크리닝 또는 검증에 사용할 수 있으며 처리량 및 병태생리학적 관련성을 크게 향상시킵니다. 2. Human Taste Bud Epithelial Models for Bitter, Sweet & Salty Profiling Eurofins의 인간미뢰 상피세포 (human taste bud epithelial cell, hTBEC) platform은 감각 연구에 이용됩니다. 인간조직에서 유래한 1

표적단백질 분해 (Target Protein Degradation, TPD)는 세포내 표적 단백질을 제거하기 위해 이종기능성 소분자 분해제, 즉 "degrader"를 사용하는 것을 말합니다. PROTAC은 대표적인 TPD 기술을 이용한 플랫폼으로, E3 유비퀴틴 ligase에 결합하는 부분과 표적단백질에 결합하는 부분이 Linker로 연결되어 있습니다. 양쪽의 부분들이 각각 표적단백질과 E3 ligase 와 결합함으로써 표적단백질의 폴리유비퀴틴화를 유도하고, 이를 인지한 프로테아좀의 활성에 의한 단백질 분해가 유도됩니다.  단순히 표적 단백질을 억제하는 것보다 분해하는 것은 여러가지 중요한 잇점을 가집니다. Degrader/PROTAC degrader의 메커니즘은 혁신적인 치료 플랫폼이 될 가능성이 있습니다.   Schematic showing the mechanism of action of PROTAC Degraders. PROTAC 장점 타겟단백질을 분해하는 기술은 RNAi 및 CRISPR 유전자 편집 방법에 비해 다음과 같은 장점이 있습니다. 세포에 도입하기 위해 발현벡터를 만들거나 transfection 하는 과정이 불필요하여, 쉽고 사용이 편리합니다. 사용된 degrader의 용량을 변경하여 단백질 분해 수준을 쉽게 조정할 수 있습니다. degrader는 다양한 세포주에 적용할 수 있습니다. degrader는 washing을 통해 제거되므로, 효과가 지속되는 시간을 제어하기가 편리합니다. degrader는 small molecule 하나만 이용하는 것에 비해 타겟에 대한 선택성이 향상됩니다.  Degrader의 디자인과 합성 Degrader는 E3 ligase ligand, linker 및 POI ligand의 세가지 구성요소로 이루어 집니다. 현재까지 발표된 대부분의 degrader는 각각 CRL2 및 CRL4 E3 복합체 내에서 E3 ligase VHL(Von Hippel-Lindau) 및 CRBL(Cereblon)을 활용합니다.

DNA가 유전독성 물질에 지속적으로 노출될 경우 유전자 발현, 1차 서열, 전위 등의 변화를 초래하여 결국 질병을 유발합니다. 다양한 형태의 DNA 손상 중에서 가장 위험한 것은 DNA 두가닥이 모두 파손되는 이중 나선 절단( Double-Strand Break,  DSB)으로, 염기의 상보성을 이용한 복구가 불가능하고 DSB가 발생한 지점부터 DNA 복제와 전사가 멈추게 됩니다.  DSB로 인한 위협에 대처하기 위해 세포는 DNA를 감지하고, 신호 및 복구하는 여러 메커니즘을 개발했습니다. 동물 세포의 DNA 복구 경로는 HR 및 NHEJ의 두 가지 주요 범주로 나눌 수 있습니다. 상동재조합 : Homologous Recombination (HR) 상동 재조합(Homologous recombination, HR)은 DNA 이중 가닥 파손(DSB) 복구를 위한 필수 경로이며, 이는 별개의 요소와 유전적 결과를 갖는 다양한 하위 경로를 통해 진행될 수 있습니다. HR은 DNA복제 및 세포분열시기 (S-phase)에 상동염색체의 유전정보를 이용하여 DNA를 복구하는 시스템입니다. 비상동 끝점 결합 : Non-Homologous End Joining (NHEJ) NHEJ는 모든 동물 세포의 주요 복구 경로이며 전체 세포 주기 동안 지속적으로 작동합니다. NHEJ은 절단된 부분을 바로 연결함으로써 DNA 이중나선 절단을 간단하고 빠르게 바로 복구 하지만, 염기서열의 일부가 제거되어 유전 정보의 손실로 인한 오류가 발생할 수 있습니다.  Topogen Cell Based Screening Kit for DNA repair  Topogen에서는 HR 및 NHEJ를 이용한 DNA 복구 경로를 분석하기 위한 cell을 제공합니다. DNA 복구 프로세스에 영향을 미치는 agent (약물, 천연물, 저분자, 합성, miRNA 및 유전자)를 스크리닝하거나 식별할 수 있도록 설계된 세포 기반 리포터 키트입니다. HR 및 NHEJ 에 대한 특정 리포터 기반 분석은 항암 약물 발견 프