CUT&Tag 기술은 항체로 표지된 chromatin이 Tn5 transpose와 Protein AG에 의해 선택적으로 절단되고 시퀀싱 어댑터가 태깅되면서 반응 혼합물에서 직접 증폭되어 (Direct-to-PCR) 라이브러리 필요없이 높은 민감도로 크로마틴 시퀀싱을 진행할 수 있는 방법으로, PTM 매핑에 권장됩니다.  EpiCypher의 CUT&Tag Kit은 세포에서 정제된 시퀀싱 라이브러리 준비에 필요한 모든 시약을 제공합니다. 최근 출시된 Version 2 제품은 프로토콜과 버퍼구성을 최적화하여 샘플 소실을 최소화합니다.  CUT&Tag이 왜 필요한가요? 기존의 ChIP 기술로는 불가능한 단순화된 workflow가 필요할 때, High throughput 크로마틴 매핑 분석이 필요할 때, 세포수가 적을 때, 더 높은 해상도의 데이터가 필요할 때 유용합니다.  CUT&Tag이 ChIP-seq이나 CUT&RUN에 비해 훨씬 빠른 이유는 무엇인가요? 세포 용해, 염색질 단편화 과정 없이 천연 세포에서 15분 안에 핵을 수확하여 자성 ConA 비드와 자석 랙을 통해 신속하게 세척과정을 수행할 수 있고, 시퀀싱 어댑터를 직접 추가함으로써 표준 라이브러리를 만들 필요가 없어 샘플 손실이 줄어듭니다. 8 strip tube에서 PCR mix와 indexing primer, tagmented DNA를 바로 증폭할 수 있어 시간이 단축되므로, 시간에 민감한 프로젝트의 경우 효과적입니다. ChIP-seq에 비해 CUT&Tag에서 더 적은 수의 셀을 사용할 수 있는 이유는 무엇인가요? ChIP-seq에서는 input 염색질을 준비하려면 cross-linking, chromatin sonication 이나 fragmentation이 필요하고, IP 단계에서 단편화된 염색질 pool에 항체가 추가됩니다. 항체가 표적에만 결합해야 하지만 IP 방법은 항상 off-target fragment를 생성하여, 시퀀싱에서 높은 백그라운드와

CUT&RUN이란? CUT&RUN은 Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease를 의미합니다. Lectin 단백질로 코팅된 magnetic ConA bead는 세포막이나 핵의 막에서 발견되는 당접합체(glycoconjugates)를 결합하는데 사용됩니다. 타겟(예, PTM)에 대한 항체는 막을 통과하여 타겟 염색질에 붙습니다. 다음으로 Protein AG micrococcal nuclease (pAG-MNase)가 첨가되는데, 이는 항체 결합 염색질에 결합합니다. 염화칼슘을 첨가하면 효소의 표적 복합제 절단이 활성화되어 세포밖으로 확산될 수 있습니다.  DNA는 상층액에서 수집되어 library 준비 전에 정제됩니다. 실험의 성공여부는 시퀀싱 코어 또는 벤치탑 sequencer를 사용하여 시퀀싱하기 전에 바이오분석기 추적을 통해 테스트됩니다. 결과가 나오면 통합 genome 브라우저 또는 적절한 시각화 도구를 사용하여 데이터를 분석하고 볼수 있습니다. EpiCypher의 CUT&RUN 프로토콜은 히스톤 PTMs, 전사 인자, 염색질 리모델러, Writer 및 Reader의 게놈 프로파일링을 위한 검증된 플랫폼을 제공합니다. 세포 타입 및 조건 CUT&RUN을 처음 사용하거나, 새로운 항체를 테스트하는 경우, 세포유형, 실험조건, 대조 및 항체를 신중하게 고려하는 것이 중요합니다. EpiCypher의 CUT&RUN 프로토콜은 다양한 세포 및 샘플 유형과 호환됩니다.  Histone PTMs 및 transcription factor를 프로파일링하는 경우, 부착 세포와 현탁 세포주, 조직 샘플 등, native cell 또는 고정되지 않은 세포가 이상적입니다. CUTANA CUT&RUN 프로토콜은 약하게 cross-linking된 cell에도 사용할 수 있습니다. 일시적인 염색질 상호작용과 histone PTMs의 특정 하위 집합을 프로파일링 하려면 샘플을 고정하는 것을 권장

ChIP-seq을 진행하고 계시나요?   차세대 크로마틴 매핑 기술인 CUT&RUN과 CUT&Tag에 대해 들어보셨는지요?  EpiCypher에서는 실험실 경험을 바탕으로 최상의 크로마틴 매핑 분석법을 선택하는 3가지 Key point를 안내해 드립니다.  Key Point 1:  일단 ChIP-seq으로 부터 벗어나자! 전통적으로 이용되어 오고 있는 ChIP-seq 방법은 다음과 같은 단점이 있습니다.  수백만 개의 세포 필요 - 희귀한 세포, 혹은 임상 샘플 프로파일링시 제한적입니다. 최적화를 위해 기술적으로 어려운 실험 과정 필요 - cross-linking, chromatin fragmentation, immunoprecipitation 과정을 거치는 동안 노이즈와 sequencing artifact문제가 발생합니다. 시간이 많이 걸리는 프로토콜 - 세포에서 시퀀서에 로딩하는 데 까지 최대 1주일을 소비해야 합니다.  높은 시퀀싱 depth 필요 - ChIP은 백그라운드에서 충분한 신호를 보내기 위해 일반적으로 library당 20-40M의 read가 필요합니다.  낮은 데이터 품질 및 신뢰성 - 백그라운드가 높고, 수율은 낮습니다.    낮은 처리량 - 대규모 분석이 어려워 시간이 많이 소요되고 시퀀싱 비용이 높습니다. 그럼에도 불구하고 ChIP-seq은 수십년 동안 사용되어 온 최고의 크로마틴 매핑 기술이었습니다. 그러나 최근에는 CUTANA CUT&RUN 및 CUT&Tag 분석을 통해 이런 문제가 해결되었습니다. Figure 1: ChIP-seq fails the major requirements for chromatin mapping assays, but historically was the best option available. CUTANA™ CUT&RUN and CUT&Tag assays provide a new approach for high-resolution chromatin profili

ChIP-Seq은 타겟단백질이 결합된 크로마틴 부위를 침전시켜 농축하고 그 시퀀스를 NGS로 분석하는 기술입니다. 그러나 ChIP-Seq은 세포의 양이 적은 샘플의 경우 DNA를 얻기 힘들고, 노이즈 백그라운드가 높다는 한계를 갖고 있습니다.  이에 반해 CUT&RUN 시퀀싱은 온전한 세포로부터 타겟 단백질만을 잘라내는 방식으로, ChIP-Seq에 비해 적은 수의 cell로도 분석이 가능하고, 시간이 단축되며, signal to noise ratio가 월등히 향상되어 Chromatin NGS에 효과적으로 이용될 수 있는 툴 입니다.  CUTANA™ CUT&RUN Assays 높은 민감도 (5000-500,000 cells) Experimental control 제공 pAG-MNase로 타겟 fragmentation Spike-In DNA control 제공 [ Workflow ] Magnetic bead에 cell 고정 타겟 DNA에 결합되어 있는 단백질에 대한 항체 처리 pAG-MNase로 타겟 nucleosome 컷팅 CaCl2+로 nucleosome complex 유리 및 분리 DNA 추출 및 library prep NGS 진행 제품 보러가기 CUTANA™ CUT&Tag Assays 높은 민감도 (1000-100,000 cells) Cell에서 DNA까지 하나의 tube에서 진행 Library prep 과정이 생략되어 시간 절감 ChIP-seq 대비 3배 이상 비용 절감 [ Workflow ] Magnetic bead에 nuclei 고정 타겟 DNA에 결합되어 있는 단백질에 대한 항체 처리 pAG-Tn5로 타겟을 분리하고 sequencing adapter 부착 PCR 후 DNA 추출하고 시퀀싱 바코드 adapter 부착 NGS 진행 제품 보러가기 Epicypher 제품 문의 : 고마바이오텍(주) (02-579-8787)