ChIP-seq vs. CUT&RUN vs. CUT&Tag (ChIP-seq을 대체하는 차세대 크로마틴 매핑기술 비교)

ChIP-seq을 진행하고 계시나요?  
차세대 크로마틴 매핑 기술인 CUT&RUN과 CUT&Tag에 대해 들어보셨는지요? 

EpiCypher에서는 실험실 경험을 바탕으로 최상의 크로마틴 매핑 분석법을 선택하는 3가지 Key point를 안내해 드립니다. 


Key Point 1: 일단 ChIP-seq으로 부터 벗어나자!

전통적으로 이용되어 오고 있는 ChIP-seq 방법은 다음과 같은 단점이 있습니다. 

  • 수백만 개의 세포 필요 - 희귀한 세포, 혹은 임상 샘플 프로파일링시 제한적입니다.
  • 최적화를 위해 기술적으로 어려운 실험 과정 필요 - cross-linking, chromatin fragmentation, immunoprecipitation 과정을 거치는 동안 노이즈와 sequencing artifact문제가 발생합니다.
  • 시간이 많이 걸리는 프로토콜 - 세포에서 시퀀서에 로딩하는 데 까지 최대 1주일을 소비해야 합니다. 
  • 높은 시퀀싱 depth 필요 - ChIP은 백그라운드에서 충분한 신호를 보내기 위해 일반적으로 library당 20-40M의 read가 필요합니다. 
  • 낮은 데이터 품질 및 신뢰성 - 백그라운드가 높고, 수율은 낮습니다.   
  • 낮은 처리량 - 대규모 분석이 어려워 시간이 많이 소요되고 시퀀싱 비용이 높습니다.

그럼에도 불구하고 ChIP-seq은 수십년 동안 사용되어 온 최고의 크로마틴 매핑 기술이었습니다. 그러나 최근에는 CUTANA CUT&RUN 및 CUT&Tag 분석을 통해 이런 문제가 해결되었습니다.

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Figure 1: ChIP-seq fails the major requirements for chromatin mapping assays, but historically was the best option available. CUTANA™ CUT&RUN and CUT&Tag assays provide a new approach for high-resolution chromatin profiling. Created with BioRender.com.


CUT&Tag와 CUT&RUN은 ChIP-seq에 비해 많은 장점을 제공합니다. 두 분석법 모두, cross-linking, fragmentation, 또는 IP 없이 온전히 핵 또는 세포에서 항체에 결합된 크로마틴을 선택적으로 표적으로 하여 낮은 백그라운드와 정교한 신뢰성으로 고품질 프로필을 제공합니다. 또한 CUTANA CUT&RUN 및 CUT&Tag은 ChIP-seq보다 훨씬 빠르면서, 더 적은 수의 셀을 사용하고, 시퀀싱 depth가 적습니다.

질문1) 염색질의 표적 위치를 안정화하기 위해 cross-linking이 필요한 일시적으로 상호 작용하는 단백질을 연구하고 있습니다. ChIP-Seq을 CUT&RUN으로 바꾸어도 되나요?

CUT&RUN은 전사 인자를 포함하여 일반적으로 기본 조건에서 테스트한 모든 대상 클래스에 대해 작동합니다. 이를 통해 높은 백그라운드, 시퀀싱 아티팩트 및 IP 가변성이 없는 깨끗한 데이터를 생성할 수 있습니다. CUTANA 분석은 가볍거나 중간 정도의 cross-linking 조건과 호환됩니다 (Figure 2). 그러나 ChIP-seq에 필요한 과도한 fixation 전략은 CUT&RUN(또는 CUT&Tag)에 적용하면 안 됩니다.
Figure 2: Genome-wide enrichment is preserved across sample processing conditions in CUT&RUN. Heatmaps show CUT&RUN H3K4me3 signal at transcription start sites (TSS) using fresh, frozen, or cross-linked K562 cells or fresh nuclei. Gene rows are aligned across conditions, with red indicating high H3K4me3 enrichment.


질문2) CUT&RUN 결과를 기존 ChIP-seq 데이터와 비교하려고 합니다. ChIP-seq을 계속 수행해야 할까요?

ChIP-seq 및 CUT&RUN은 별개의 프로토콜이지만 원시 시퀀싱 데이터는 유사하며 동일한 도구를 사용하여 처리 및 시각화됩니다. 이러한 데이터 세트를 비교하는 것은 간단하며 peer-reviewed study에서 여러 번 발표되었습니다. 또한 동일한 세포주 및 대상에서 ChIP-seq 및 CUT&RUN 데이터를 분석한 결과 일치도가 높았습니다. 주요 차이점은 CUT&RUN 데이터는 노이즈 백그라운드가 훨씬 낮고 10배 더 적은 세포와 시퀀싱 read가 필요하다는 것입니다.


질문3) 이미 작동하는 우수한 ChIP-seq 프로토콜 및/또는 항체를 가지고 있습니다. ChIP-seq을 고수해야 하지 않을까요?

최고의 ChIP-seq 프로토콜도 CUT&RUN에 비해 더 많은 시간, 세포 및 시퀀싱이 필요합니다. 또한 ChIP-seq은 본질적으로 처리량이 적고 비용이 많이 들며 백그라운드가 높습니다. 이러한 문제는 CUTANA™ CUT&RUN 분석 워크플로우에서 완전히 해결됩니다. CUT&RUN은 또한 ChIP-seq을 위한 표적 및 조직 특이적 cross-linking, 단편화 및 IP 조건의 노동 집약적인 개발과 완전히 대조적으로 대부분의 표적 및 세포 유형에 대해 최소한의 최적화를 요구합니다.


질문4) ChIP용으로 잘 작용하는 항체가 있습니다. 

항체 성능은 ChIP-seq을 선택하는 좋은 근거가 아닙니다. ChIP 등급 항체는 특히 히스톤 PTM의 경우 신뢰할 수 없는 것으로 악명이 높습니다. EpiCypher는 히스톤 라이신 메틸화 및 아실화 PTM에 대한 항체의 70% 이상이 허용할 수 없는 교차 반응성 및/또는 표적 효율을 나타내는 것을 발견했습니다(chromatinantibodies.com). 여기에는 H3K4me3, H3K9me3, H3K27ac 및 H3K27me3에 대해 많이 인용되는 항체가 포함됩니다. 이는 염색질 생물학에서 잘 연구되어 있습니다. 전사 인자와 같은 비히스톤 PTM 표적은 유사한 문제에 직면해 있습니다.


질문5) CUT&RUN(또는 CUT&Tag)에서는 입력 샘플을 시퀀싱할 수 없습니다. enrichment를 어떻게 결정하고 비특이적 백그라운드를 조사할 수 있을까요?

IgG에 대한 항체를 사용하여 음성 대조군 반응을 실행할 것을 권장합니다. IgG는 open chromatin에서 백그라운드 및/또는 비특이적 신호를 모니터링하기 위한 탁월한 컨트롤입니다.

peak를 호출하고 농축을 결정하기 위해 EpiCypher는 CUT&RUN에서 잘 작동하는 ChIP-seq용 peak 호출 프로그램인 MACS2 및 SICER을 일상적으로 사용합니다. SICER는 날카로운 농축 peak (예: H3K4me3)와 광범위한 농축 영역(예: H3K27me3)의 분석을 위해 조정할 수 있습니다. 다른 옵션으로는 CUT&RUN 데이터용으로 설계된 peak 호출기인 SEACR와 단일 cell 분석을 포함하여 CUT&RUN 및 CUT&Tag 데이터용으로 설계된 CUT&RUNTools 2.0 파이프라인이 있습니다. 여러 프로그램을 테스트하고 관심 대상을 충실히 나타내는 프로그램을 선택하는 것이 좋습니다. 자세한 내용은 CUTANA™ CUT&RUN kit 설명서(FAQ 섹션)를 참조하십시오.





Key Point 2: CUT&RUN은 대부분의 크로마틴 매핑 분석에 사용될 수 있다.

CUT&RUN은 대부분의 후성유전체 매핑 실험에 이상적인 분석법입니다. 필요한 세포 수, 대상 호환성(Figure 3), 처리량 및 시퀀싱 비용 간의 적절한 균형을 제공합니다. 이 프로토콜은 전문가 및 비전문가 수준의 실험실 모두에 적용할 수 있을 만큼 간단하며 CUTANA™ CUT&RUN kit를 사용함으로써 더 쉽게 실험을 진행할 수 있습니다. 

CUT&RUN이 ChIP-seq에 비해 편리한 점은 다음과 같습니다. 

  • 다양한 대상에 대한 고해상도 데이터: CUT&RUN은 히스톤 PTM 및 전사 인자, 후생유전학 reader, writer, eraser를 포함한 염색질 관련 단백질과 호환됩니다(그림 3). CUT&RUN은 또한 ChIP-seq을 사용하여 프로파일링하기 어려웠던 크로마틴 리모델링 효소에 대한 강력한 프로파일을 생성합니다.


Figure 3: CUTANA™ CUT&RUN assays generate robust profiles for diverse target classes using only 3-8 million sequencing reads per reaction. Each experiment was performed using the CUTANA™ CUT&RUN Kit and 500,000 K562 cells.


  • 적은 수의 세포 사용: 500,000개 세포로 시작하는 것이 권장되지만 CUTANA CUT&RUN은 표준 프로토콜을 변경하지 않고도 5,000개 세포까지 고품질 데이터를 생성할 수 있어 더 많은 대상, 희귀 세포 유형 및 귀중한 샘플을 분석할 수 있습니다. CUT&RUN은 마우스 및 인간 1차 세포, 환자 유래 이종이식편, FACS 분류 세포, 면역 세포 등을 프로파일링하는 데 사용되었습니다.
  • 간소화된 프로토콜: CUTANA CUT&RUN 프로토콜을 사용하면 단 3일 만에 cell 부터 시퀀서에 라이브러리 load까지 진행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 다중 채널 피펫터 및 8-strip tube와 함께 사용하도록 설계되어 분석 재현성을 개선하고 처리량을 증가시킵니다.
  • 시퀀싱 비용 감소: 고품질 프로필에는 300만~800만 시퀀싱 판독만 필요하므로 시퀀싱 실행당 더 많은 샘플을 다중화할 수 있습니다.
  • 최적화가 적은 사용자 친화적인 워크플로우: 위에서 설명한 것처럼 CUT&RUN은 ChIP-seq의 가장 까다로운 부분(염색질 단편화 등)을 건너뛰고 최적화가 덜 필요합니다. EpiCypher는 CUTANA™ CUT&RUN kit 및 CUT&RUN library prep kit를 통해 이 프로세스를 더욱 쉽게 만들어 고품질 염색질 매핑을 위한 종단 간 솔루션을 제공합니다.






Key Point 3: 초보자라면 CUT&Tag보다는 CUT&RUN을 사용하도록 한다.

CUT&Tag은 염색질 매핑 분석에 대한 광범위한 전문 지식을 갖춘 과학자에게 가장 적합합니다. 다음과 같은 경우 CUT&Tag 방법을 권장하지 않습니다.

  • 후성유전체 매핑 어세이의 새로운 기능
  • CUTANA 염색질 매핑 분석을 시도하는 ChIP-seq 사용자
  • 새 대상 매핑 및/또는 새 세포 유형 사용 시도
  • 전사 인자 및 기타 염색질 관련 단백질과 같은 풍부도가 낮은 표적 매핑
  • 이러한 각각의 시나리오에서 EpiCypher는 사용자 친화적인 프로토콜이 있고 대부분의 대상 및 세포 유형에 대해 신뢰할 수 있는 프로필을 생성하는 CUT&RUN을 사용할 것을 제안합니다. 아래에서는 CUT&Tag의 관련 단점과 이 흥미로운 기술의 핵심 장점을 강조하는 이상적인 응용 프로그램에 대해 설명합니다.


CUT&Tag은 CUT&RUN에 비해 기술적으로 더 어렵습니다.

많은 연구자들이 염색질 매핑 실험을 위해 CUTANA CUT&Tag를 사용하려고 합니다. 왜냐면 이 방법은 기존의 라이브러리 준비 단계를 건너뛰고 고품질 시퀀싱 트랙에 100,000개의 핵만 필요하기 때문입니다. EpiCypher는 독점적인 Direct-to-PCR 전략으로 CUT&Tag 프로세스를 더욱 간소화하여 사용자가 하나의 튜브에서 세포에서 PCR 증폭 라이브러리로 이동할 수 있도록 합니다. 

그러나 EpiCypher의 경험에 따르면 CUT&Tag 분석은 강력한 염색질 프로파일을 생성하기 위해 높은 숙련화된 핸들링을 필요로 합니다. 감소된 세포 입력으로 인해 CUT&Tag는 분석 설정 및/또는 샘플 준비, ConA 비드 손실 및 비특이적 항체의 오류에 매우 민감합니다. 또한 CUT&Tag는 최적화와 문제 해결 전술에 대한 철저한 지식이 필요한 경우가 많습니다.

예를 들어, 실험자들이 CUTANA™ Direct-to-PCR CUT&Tag 프로토콜을 사용하여 보고한 일반적인 문제는 Indexing PCR 후 수율이 낮거나 없다는 것입니다. 수율 감소에 대한 많은 잠재적 원인이 있기 때문에 이러한 문제를 해결하는 것은 간단하지 않습니다. 
  • 너무 많은 핵(인덱싱 PCR을 억제할 수 있음)
  • 불량한 샘플 준비 및/또는 너무 적은 핵
  • ConA 비드 건조로 인한 샘플 손실
  • 전사 인자와 같은 저풍부 표적
  • 불량한 항체 특이성 및/또는 효율성
  • CUT&Tag은 CUT&RUN에 비해 더 높은 read duplication rate를 갖는 경향이 있으며 open chromatin 영역에서 백그라운드 신호를 나타낼 수 있습니다. 이러한 이유로 대부분의 사용자에게 CUT&RUN을 권장합니다.



CUT&Tag이 적용되지 않는 경우도 있습니다. 

현재 CUTANA™ CUT&Tag는 히스톤 PTM(Figure 4) 및 선택 전사 인자(즉, CTCF)를 매핑하는 데 권장됩니다. EpiCypher는 종종 염색질에 약하게 결합되어 고염 CUT&Tag 세척 중에 제거되는 염색질 관련 단백질을 매핑하는 경우에는 CUT&Tag를 권장하지 않습니다. 이것은 분석의 주요 단점이며 대부분의 사용자에게 CUT&RUN을 계속 제안하는 이유 중 하나입니다.



Figure 4: CUTANA™ CUT&Tag is ideal for mapping histone PTMs. Results were generated using 100,000 K562 nuclei and 3-8 million reads per reaction.



CUT&Tag은 ultra-low cell number 및 특수 응용 분야에 이상적입니다.

그럼에도 불구하고 CUT&Tag은 많은 프로젝트에 적용됩니다. CUT&Tag은 소수의 세포에서 염색질 매핑을 위해 의도적으로 설계되어 CUT&RUN에 보완 기술을 제공합니다. 원본 논문은 단일 세포 프로파일링에 대한 적용을 테스트했으며 기술에 대한 추가 수정으로 단일 세포 후성유전체학에 대한 CUT&Tag의 감도가 증가했습니다.

CUTANA™ CUT&Tag가 low input application에 이상적인 이유는 무엇입니까?

Tn5 tagging은 기존의 cross-linking, 염색질 단편화, IP 및 라이브러리 준비 단계를 제거하여 실험 시간을 줄이고 target recovery를 최대화합니다. 매우 적은 수의 세포, 혹은 단일 세포에서 매핑을 시도할 때는 처리 단계를 최소화하는 것이 중요합니다. CUT&Tag에서 pAG-Tn5는 손상되지 않은 핵의 항체 결합 염색질에 시퀀싱 어댑터를 삽입하여 ChIP-seq 진행시 가장 시간적으로 소모가 많은 단계를 제거합니다.
EpiCypher의 독점적인 Direct-to-PCR CUT&Tag 프로토콜은 하나의 튜브에서 세포에서 PCR 증폭 DNA 라이브러리로 이동할 수 있도록 하여 이 프로세스를 간소화합니다. 세포/DNA를 세척하거나 새 튜브로 옮기거나 단계 사이에 정제할 때마다 재료가 손실될 위험이 있습니다. EpiCypher의 고유한 접근 방식에는 단일 DNA 정제 단계가 필요하며 단 2일 만에 완료할 수 있습니다.
Combinational indexing과 같은 복잡한 맞춤형 멀티플렉싱 전략을 가능하게 합니다. 이러한 접근 방식은 단일 실험에서 고유하게 바코드를 지정할 수 있는 개별 세포의 수를 증가시키며, 이는 단일 세포 프로파일링의 핵심입니다. EpiCypher는 새로운 CUT&Tag 바코드 전략을 사용하거나 개발하는 실험자를 위해 uncharged pAG-Tn5를 제공합니다.
CUTANA™ CUT&Tag 프로토콜에 대한 기본 입력은 100,000개의 핵이지만 선택 대상에 대해 비교 가능한 데이터를 1,000개의 핵까지 생성할 수 있습니다 (Figure 5). CUTANA CUT&RUN Assays의 검증된 최저 입력값은 5,000개 세포이므로 CUTANA CUT&Tag은 초고감도 후성유전체학의 한계를 뛰어넘는 연구자들에게 고유한 이점을 제공합니다.



Figure 5: CUT&Tag generates robust profiles for low abundance (H3K4me3) and high abundance (H3K27me3) histone PTMs using as few as 1,000 cells. Data were generated using the CUTANA™ CUT&Tag Protocol and K562 cells.




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