더욱 향상된 새버전 CUT&Tag 출시! 무엇이 달라졌을까?
CUT&Tag 기술은 항체로 표지된 chromatin이 Tn5 transpose와 Protein AG에 의해 선택적으로 절단되고 시퀀싱 어댑터가 태깅되면서 반응 혼합물에서 직접 증폭되어 (Direct-to-PCR) 라이브러리 필요없이 높은 민감도로 크로마틴 시퀀싱을 진행할 수 있는 방법으로, PTM 매핑에 권장됩니다.
EpiCypher의 CUT&Tag Kit은 세포에서 정제된 시퀀싱 라이브러리 준비에 필요한 모든 시약을 제공합니다. 최근 출시된 Version 2 제품은 프로토콜과 버퍼구성을 최적화하여 샘플 소실을 최소화합니다.
CUT&Tag이 왜 필요한가요?
기존의 ChIP 기술로는 불가능한 단순화된 workflow가 필요할 때, High throughput 크로마틴 매핑 분석이 필요할 때, 세포수가 적을 때, 더 높은 해상도의 데이터가 필요할 때 유용합니다.
CUT&Tag이 ChIP-seq이나 CUT&RUN에 비해 훨씬 빠른 이유는 무엇인가요?
세포 용해, 염색질 단편화 과정 없이 천연 세포에서 15분 안에 핵을 수확하여 자성 ConA 비드와 자석 랙을 통해 신속하게 세척과정을 수행할 수 있고, 시퀀싱 어댑터를 직접 추가함으로써 표준 라이브러리를 만들 필요가 없어 샘플 손실이 줄어듭니다. 8 strip tube에서 PCR mix와 indexing primer, tagmented DNA를 바로 증폭할 수 있어 시간이 단축되므로, 시간에 민감한 프로젝트의 경우 효과적입니다.
ChIP-seq에 비해 CUT&Tag에서 더 적은 수의 셀을 사용할 수 있는 이유는 무엇인가요?
ChIP-seq에서는 input 염색질을 준비하려면 cross-linking, chromatin sonication 이나 fragmentation이 필요하고, IP 단계에서 단편화된 염색질 pool에 항체가 추가됩니다. 항체가 표적에만 결합해야 하지만 IP 방법은 항상 off-target fragment를 생성하여, 시퀀싱에서 높은 백그라운드와 artifact를 나타냅니다. 이 부분을 극복하기 위해 많은 수의 cell을 이용해야 합니다.
반면 CUT&Tag은 자기 비드에 결합된 손상되지 않은 핵을 사용하여 수행되며, IP 단계가 필요하지 않아 백그라운드가 감소됩니다. 또한 라이브러리 준비가 필요없어 DNA 정제가 불필요하여 샘플 소실이 적습니다. 결과적으로 ChIP-seq에 비해 약 10배 적은 시료로 실험이 가능합니다.
CUT&Tag 프로토콜과 관련하여 과학자들이 겪는 가장 일반적인 문제는 무엇인가요?
CUT&Tag 프로토콜에서의 주요 이슈는 수율이 낮거나 전혀 없다는 것입니다. 이는 잘못된 샘플준비, 실험중 샘플 손실, ConA 비드 문제, 불충분한 반응 혼합등 다양한 변수로 발생할 수 있습니다. 또한 비드가 용액에 균일하게 남아 있어야 항체와 pAG-Tn5의 균일한 분포와 효율적인 indexing PCR을 지원할 수 있습니다. 그러나 프로토콜 2일차에서 ConA 비드 슬러리가 끈적해져서 재현탁하기 어려울수 있으며, 특히 tagging 후에는 더욱 그렇습니다.
Version 2 CUT&Tag Kit은 어떤 부분이 업데이트되었나요?
EpiCypher팀은 사용자가 지속적으로 고품질 CUT&Tag 데이터를 생성하도록 각 프로토콜 단계를 재검토하고, buffer의 성분이 핵이나 세포의 생리에 영향을 미치는 부분에 대해서 논의 및 테스트를 진행하였습니다. post tagmentation step에서 샘플 소실이 없도록 샘플 처리, 버퍼구성, 프로토콜 단계에 대해 광범위하게 비교 테스트를 수행하였습니다. TAPS 완충액의 염 농도가 낮으면 삼투압 변화와 핵 용해가 발생했습니다. 혼합하는 기술도 특히 중요했으며, 샘플 손실에 영향을 미쳤습니다. 예를 들어 SDS release buffer를 추가한 후 샘플이 끈적해져서 파이펫팅이 불가능해지거나, 프로토콜 중 vortexing으로 인해 튜브 측면에 물질이 달라붙어 샘플이 소실되는 것도 확인하였습니다. 반복된 실험을 기반으로, tagmentation 후 TAPS buffer 세척을 제거하고, Pre-Wash buffer로 대체하였습니다. 구체적인 재현탁 및 혼합 지침도 추가하였습니다. 초보자와 숙련자 모두로부터 성공률을 높일 수 있는 실험환경으로 재탄생하였습니다.
