CUT&RUN 프로토콜
CUT&RUN이란?
CUT&RUN은 Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease를 의미합니다.
Lectin 단백질로 코팅된 magnetic ConA bead는 세포막이나 핵의 막에서 발견되는 당접합체(glycoconjugates)를 결합하는데 사용됩니다. 타겟(예, PTM)에 대한 항체는 막을 통과하여 타겟 염색질에 붙습니다. 다음으로 Protein AG micrococcal nuclease (pAG-MNase)가 첨가되는데, 이는 항체 결합 염색질에 결합합니다. 염화칼슘을 첨가하면 효소의 표적 복합제 절단이 활성화되어 세포밖으로 확산될 수 있습니다.
DNA는 상층액에서 수집되어 library 준비 전에 정제됩니다. 실험의 성공여부는 시퀀싱 코어 또는 벤치탑 sequencer를 사용하여 시퀀싱하기 전에 바이오분석기 추적을 통해 테스트됩니다. 결과가 나오면 통합 genome 브라우저 또는 적절한 시각화 도구를 사용하여 데이터를 분석하고 볼수 있습니다.
EpiCypher의 CUT&RUN 프로토콜은 히스톤 PTMs, 전사 인자, 염색질 리모델러, Writer 및 Reader의 게놈 프로파일링을 위한 검증된 플랫폼을 제공합니다.
세포 타입 및 조건
CUT&RUN을 처음 사용하거나, 새로운 항체를 테스트하는 경우, 세포유형, 실험조건, 대조 및 항체를 신중하게 고려하는 것이 중요합니다. EpiCypher의 CUT&RUN 프로토콜은 다양한 세포 및 샘플 유형과 호환됩니다.
Histone PTMs 및 transcription factor를 프로파일링하는 경우, 부착 세포와 현탁 세포주, 조직 샘플 등, native cell 또는 고정되지 않은 세포가 이상적입니다. CUTANA CUT&RUN 프로토콜은 약하게 cross-linking된 cell에도 사용할 수 있습니다. 일시적인 염색질 상호작용과 histone PTMs의 특정 하위 집합을 프로파일링 하려면 샘플을 고정하는 것을 권장합니다. 그러나 희귀한 PTMs나 단백질을 매핑할 때 핵을 이용할 수도 있습니다. 또한 면역세포 집단을 프로파일링할 때도 핵을 사용하는 것이 좋습니다.
처음 수행하는 경우 샘플당 최소 500,000개의 세포로 시작한 다음 세포 입력을 적정하여 특정 목표 및 세포 유형에 대한 요구 사항을 결정하는 것이 좋습니다. EpiCypher의 CUT&RUN 프로토콜은 데이터 품질을 저하시키지 않으면서 500,000개에서 5000개 정도의 셀까지 최적화됩니다.
대조군 및 정규화
Control은 실험 설계의 필수 부분입니다. 적절한 제어는 성공적인 절단 및 실행 실험의 핵심이며 항상 실험 샘플과 병행하여 실행되어야 합니다.
양성 대조군의 경우 SNAP-ChIP certified H3K4me3 또는 H3K27me3와 같은 검증된 항체로 샘플을 처리하는 것이 좋습니다.
Rabbit IgG와 같이 일관된 피크를 생성하는 항체는 배경 신호의 수준을 나타내는 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 또한 시퀀싱 데이터를 정규화하기 위해 E. Coli Spike-in DNA control을 사용하는 것이 좋습니다. 실험 설계 시 이러한 신중한 고려 사항을 통해 성공 여부를 쉽게 평가할 수 있습니다.
CUT&RUN 실험 준비물
1. Buffer & Reagent
- ConA Beads (21-1401)
- SA Beads (21-1402)
- Bead Activation Buffer (21-1001)
- Pre-Wash Buffer (21-1002)
- Stop Buffer (21-1003)
- 5% Digitonin (21-1004)
- 1 M Spermidine (21-1005)
- pAG-MNase (15-1016)
- H3K4me3 Positive Control Antibody (13-0041k)
- Rabbit IgG Negative Control Antibody (13-0042k)
- E. coli Spike-in DNA (18-1401)
- CUTANA H3K4 MetStat Spike-in Controls (19-1006,19-1321,19-1334,19-1316)
- 8-strip Tubes (10-0009k)
- DNA Cleanup Columns (10-0010)
- DNA Collection Tubes (10-0011)
- 0.5 M EDTA (21-1006)
- 100 mM Calcium Chloride (21-1007)
- DNA Binding Buffer (21-1008)
- DNA Wash Buffer (21-1009)
- DNA Elution Buffer (21-1010)
2. Equipment
- 1.5, 15 and 50 mL tubes
- Low-retention filter pipette tips
- Magnetic separation rack for 1.5 mL tubes (e.g. EpiCypher 10-0012) and 8-strip Tubes (e.g. EpiCypher 10-0008)
- Qubit™ 4 Fluorometer (Invitrogen Q33238) and 1X dsDNA HS Kit (Q33230)
- 8-channel multi-channel pipettor (e.g. VWR 76169-250) and multi-channel reagent reservoirs (e.g. Thermo Fisher Scientific 14-387-072)
- Vortex (e.g. Vortex-Genie®,Scientific Industries SI-0236)
- Thermocycler (e.g. from BioRad, Applied Biosystems, Eppendorf)
- Tube nutator for incubation steps (e.g. VWR 82007-202)
CUT&RUN 실험 순서
Day1
1. Buffer 준비 (~ 30분)
2. ConA Bead Activation (~ 30분)
3. Activated Bead와 Cell binding (~30분)
4. Antibody와 반응 (~30분 + overnight)
Day2
5. pAG-MNase 처리 (~ 40분)
6. Targeted Chromatin Digestion & Release (~ 3시간)
7. DNA Elution & Purification (~ 30분)
