앞서 왜 siRNA가 off-target effect에 취약한지를 설명하였습니다.  이제 siPOOL의 특징을 살펴보겠습니다. siPOOL은 RNAi 메커니즘에 대한 이해를 기반으로 Bioinformatics-based 디자인된 30개의 최적화한 siRNA로 풀링된 siRNA 컴플렉스입니다. siPOOL로 off-target을 줄이고 on-target을 높일 수 있는 이유는 다음과 같습니다.  1. siPOOL Concept High complexity pooling   풀링된 siRNA 개개의 농도를 최저수준으로 낮추고, 시퀀스의 complexity를 높임으로써 단일 siRNA 사용 시 우려되는 off-target effect를 희석시키고, knockdown의 효율성과 재현성을 높일 수 있습니다.  siRNA 농도 최적화 실제로 과도한 양의 siRNA를 사용할 경우 off target effect는 증가합니다. 그림에서 볼 수 있듯이 siRNA농도 (nM)를 충분히 낮추어도 inhibition효과가 유지되는 것을 볼 수 있습니다. siRNA Complexity 동일한 양의 siRNA를 사용하더라도 pooling 된 siRNA를 사용할 경우 off-target effect가 감소되는 것을 볼 수 있습니다. "왜 30개의 siRNA가 필요할까요? 3-4개로는 충분하지 않기 때문입니다." Off-target 효과를 낮추기 위해 일반적으로 3~4개의 siRNA pool을 많이 사용하고 있습니다. 그러나 3~4개의 siRNA pool은 off 타겟 효과를 억제하기에 충분하지 않습니다. 아래 그림에서 보는 바와 같이 off-target luciferase reporter를 이용하여 off 타겟을 모니터링한 결과, complexity가 높을수록 off-target effect가 현저히 감소하는 것을 볼 수 있습니다. MAD2라고 하는 알려진 off-target 유전자를 Luciferase 3’UTR에 달아서 off 타겟을 모니터링하였습니다.  2. De

RNAi기반의 유전자 발현조절 현상은 1998년 최초 발견되어, 2006년 노벨 생리의학상을 받기까지 10년이 채 걸리지 않을만큼 급속하게 연구가 진보되어 왔습니다. 잘 알려진 바와 같이, RNAi 현상은 이중 가닥의 RNA (dsRNA)가, Dicer라는 리보핵산 가수분해효소에 의해 잘려 생성된 21-23bp의 짧은 RNA조각을 통해 일어납니다. siRNA는 이 짧은 RNA조각과 유사하게 작용합니다. 세포내로 도입된 siRNA는 RISC (RNA induced silencing complex)복합체와 결합한 후 활성화된 Argonaute-2 에 의해 센스가닥이 분해됩니다. 활성화된 RISC 복합체와 결합된 안티센스 가닥은 표적하는 mRNA와 결합해 이것을 분해하여 최종적으로 단백질의 형성을 억제합니다. 그래서 마이크로 RNA의 서열 특이적인 유전자를 억제시키는 siRNA가 정확하게 타겟 유전자만을 타겟팅하도록 디자인할 수만 있다면 다양한 질환연구분야에 응용할 수 있습니다. 그리고 정확하게 디자인 된 siRNA library를 이용하면 빠른 시간 내에 관심있는 signaling pathway나 질병과 관련한 타겟 후보를 선별할 수 있습니다. RNAi screening을 위한 siRNA의 장점을 살펴보면, gene silencing효과가 빠르고 dose-dependent하며, 사용방법이 어렵지 않다는 점에 있습니다. 1. 24-48시간 이내에 RNA loss를 볼 수 있고, 수일 내 단백질 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있습니다. 2. siRNA는 약물처리와 같이 dose-dependent한 결과를 나타내며, 3. 일시적으로 발현되고, 처리량을 최소화하면 타겟 단백질 발현이 다시 회복됩니다. 4. Transfection을 통해 cell 에 직접 처리가 가능하여 적용이 간편합니다. 5. Delivery system이 적합한 경우, in vivo에도 손쉽게 적용할 수 있습니다. 이러한 잇점에도 불구하고 siRNA는 off-target effect라고 하는 극복해야

RNA 간섭(RNAi)은 유전자 기능을 결정하기 위한 유전자 침묵 도구로 널리 사용됩니다. 이것은 적용이 용이하고, 광범위한 세포 유형에 적용할 수 있으며, 처리량에 따른 결과를 볼 수 있어 약물과 유사한 특성을 가지며 빠른 시간 안에 결과를 볼 수 있다는 장점이 있기 때문입니다. 그러나, 합성 RNAi 매개체, short interfering RNAs (siRNAs)가 광범위한 비표적 효과 (off-target effect)를 생성할 수 있다는 것이 널리 알려져 있고, 이로 인해 매우 가변적인 결과가 발생하여 여러 siRNA 시약을 사용하여 검증하기 위한 노력이 필요하며 비용과 시간이 소요됩니다.  siRNA 비표적화로 인한 위양성 결과를 감지하지 못한 경우 상당한 비용이 발생할 수도 있습니다. siPOOL은 단일 유전자에 대해 최적으로 설계된 30개의 siRNA로 구성된 복잡한 풀입니다. 높은 복잡성 풀링 (high complexity pooling)은 개별 siRNA의 농도를 줄여 siRNA 특정 오프 타겟 효과를 희석합니다. 대조적으로, siPOOL이 제공하는 더 큰 전사 범위로 인해 표적 유전자 knock-down 효율이 증가합니다. 그 결과, 기능 상실 표현형 (loss-of-function phenotype)이 더욱 강력해지고 재현 가능해집니다. siPOOL 구조 구조는 또한 유전자 기능을 복원하기 위해 효율적으로 작동하는 것으로 입증되었습니다. siPOOL은 유전자 기능을 빠르고 안정적으로 확인하는 이상적인 도구이며 고처리량 RNAi 기반 스크리닝에 사용하여 다양한 세포 기반 시스템에서 새로운 표적을 식별할 수 있습니다. 1. siPOOL은 어떻게 유전자 knockdown의 특이성과 효율성을 증가시키나요? siPOOL은 30개 정도의 siRNA로 구성된 높은 복잡한 pooling을 사용하여 각 siRNA의 오프 타겟 효과를 관련성이 없다고 판단할 수 있는 정도로 희석합니다. 독점 siPOOL 설계 알고리즘은 최대 전사 범위와 paralog 방지를