DNA, RNA 및 단백질등의 바이오마커는 기본 세포 기능을 이해하고 임상 질환을 진단하며 최적의 치료법을 식별하기 위한 강력한 도구입니다. 특히, RNA는 유기체에서 발생하는 동적 유전자 발현 변화를 확인하는 이상적인 지표입니다.
ACD사에서는 손상되지 않은 조직 내 단일 세포 수준의 in situ 유전자 발현을 포착하는 ISH 분석서비스를 제공합니다. 이 방법은 세포 간 상호 작용을 더 잘 이해하기 위해 형태학적 맥락에서 분자를 검출합니다.
RNAscope ISH 분석은 특허받은 신호 증폭 및 백그라운드 신호 억제 기술을 기반으로 하며 기존 RNA ISH에 비해 특이성과 민감도가 크게 향상됩니다.
가장 대표적인 RNAscope ISH 분석 사례를 소개합니다.
1. Single Cell Analysis
단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-Seq)으로 개별 세포의 전사체 프로필을 특성화하는 것은 알려진 세포 유형과 새로운 세포 유형을 식별하고 조직 구조와 기능을 이해하는 보편적인 도구가 되어 단일 세포 생물학의 새로운 시대를 열었습니다. 이는 특히 포유류 뇌 및 종양과 같이 세포 이질성이 높은 복잡한 기관 및 조직에서 사실임이 입증되었습니다. 그러나 scRNA-Seq는 분리된 세포를 활용하므로 분석 중인 세포 집단의 공간 조직이 손실됩니다. 따라서 단일 세포 및 공간적 유전자 발현 모두를 시각적으로 확인하기 위해 RNA in situ hybridization(ISH)과 같은 방법으로 scRNA-seq 분석을 보완하는 것이 필수적입니다.
RNAscope Assay는 강력하고 특이성이 높으며 민감한 멀티플렉스 RNA ISH assay로, 높은 처리량의 단일 세포 전사체 결과를 시각화할 수 있습니다. 단일 세포 수준에서 최대 4개의 특정 마커를 이용하여 최대 4개의 다중분석을 수행할 수 있습니다 (IHC와 결합 가능). 이러한 분석을 통해 단일 세포 내의 개별 유전자 및 유전자 시그니처 발현 프로필을 시각적으로 확인할 수 있으므로 전사 결과를 검증할 수 있습니다. 또한 손상되지 않은 조직 환경에서 세포 유형과 상태를 공간적으로 지역화할 수 있으므로 세포 유형별 유전자 발현 프로필을 복잡하고 이질적인 장기 및 종양의 조직 상황에 다시 매핑할 수 있습니다.
2. COVID-19 Coronavirus의 시각화
바이러스를 직접 시각화하고 형태학적 맥락에서 모든 조직과 세포의 바이러스 load를 추정합니다. 이 기술은 COVID-19 SARS-CoV-2 바이러스와 같이 새로 식별된 유전자 표적 또는 병원체에 대한 특정 항체를 개발할 필요없이, SARS-CoV-2 spike 단백질이나 SARS-CoV-2 receptor protein의 mRNA에 특이적인 RNAscope probe를 이용하여 슬라이드 상에서 감염여부를 시각화하여 볼수 있으며, 특히 IHC와 결합하여 RNA와 단백질을 동시에 검출할 수 있습니다.
- V-nCoV2019-S probe로 SARS-Cov-2 viral RNA를 시각화하고 V-nCoV2019-S sense probe로 viral replication을 detection합니다.
- virus의 세포 진입에 관여하는 cellular receptor인 ACE2와 TMPRESS, Cathepsin같은 protease를 시각화하여 잠재적으로 취약한 세포 유형을 식별합니다.
- 급성 호흡기 증후군 (ARDS)을 유발할 수 있는 IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα, IL-10등의 cytokine을 분비하는 세포를 식별합니다.
- Viral target gene의 발현을 시각화함으로써 SARS-CoV-2 pathogenesis를 더 잘 이해하고 백신이나 치료제 개발에 활용합니다.
3. WISH Whole-Mount in situ Hybridization
Whole mount in situ hybridization (WISH)은 전체 배아 또는 조직 3D 구조에 걸쳐 유전자 발현 패턴을 시각화하기 위한 매우 유익한 방식입니다. 그러나 기존의 WISH 절차는 시간이 오래 걸리고 광범위한 최적화가 필요합니다. RNAscope™ ISH 기술은 다양한 샘플에서 WISH를 혁신적으로 적용하였습니다.
Whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos
Gross-Thebing et al. were the first to publish the application of RNAscope™ ISH in whole mount zebrafish.
Combined RNAscope ISH-IHC in whole mouse inner ear
Kersigo et al. described a method for combining RNAscope™ ISH with IHC to study gene expression in a complex tissue, the whole mouse inner ear.
Dendrite shape and stability of wingless (WG) in drosophila embryos
Li et al. applied RNAscope™ ISH for the study of whole mount drosophila embryos
Verification of overexpression in whole Drosophila hearts
Another study in drosophila was done by Cannon et al. who applied RNAscope™ ISH on whole drosophila hearts.
Combined RNAscope ISH-IHC in whole mouse retinas
Dual RNAscope™ ISH-IHC in whole postnatal mouse retinas was performed by Ogura et al. to examine the effects of pericyte depletion on retinal blood vessel integrity.
3D in vivo molecular interrogation in cleared chick embryos
Morrison et al. combined RNAscope™ ISH, IHC, and FRUIT tissue clearing method to visualize and quantify transcripts and protein localization within single cells deep within intact chick embryos.
4. Neuroscience Research
신경계, 특히 뇌는 섬세한 위상학적 특성을 가진 수많은 세포와 subtype으로 구성된 가장 복잡한 조직중의 하나이며, RNAscope In situ hybridization assay는 공간 및 형태학적 맥락을 유지하면서 매우 민감하고 특정한 유전자 발현 분석을 제공하여, 단일 전사체 검출 및 단일 세포 분석에 있어 유용합니다. 특히 다중 신경 세포 마커의 동시 검출은 유전자 발현 분석 및 신경계 내 별개의 세포 집단을 시각화 할수 있고, BaseScope ISH 분석은 조직 환경에서 선택적으로 splicing된 전사체에서 특정 엑손-엑손 접합부를 검출하여, 유전자 발현 확인 이상의 관찰을 가능하게 합니다.
5. Gene Therapy/AAV
아데노 관련 바이러스(AAV)는 효과적인 유전자 치료 전달 수단으로 입증되었습니다. 유전자 치료 전임상 in vivo animal study에서 주요 고려 사항은 벡터 생체분포, 세포 특이적 흡수 및 이식유전자 발현, 생식계열 전파에 대한 안전성입니다. 조직에서 추출된 RNA 및 DNA를 분석하는 것은 간단하지만 전체 복잡한 조직에 대한 평균값만 제공하고 세포에서의 특성을 파악하기는 어렵습니다.
RNAscope™ / BaseScope™ in situ hybridization은 온전한 조직 형태의 맥락에서 PCR과 같은 정량적 분자 측정과 단일 세포의 분석 결과를 결합합니다. 또한, RNAscope는 AAV 벡터 DNA와 이식유전자 mRNA 발현을 동시에 검출할 수 있으며 세포 마커와 함께 multiplex로 관찰할 수 있습니다. 일반적인 FFPE 조직에서 AAV를 간단하면서도 신뢰할 수 있는 방법으로 분석합니다.
- 고정 조직상에서 AAV 벡터 DNA 검출 및 정량화
- AAV promoter 영역과 anti-sense strand를 바탕으로 설계된 probe
- 내인성 전사체에 대한 교차없이 human, codon-optimuzed transgene RNA 검출
- 동물 모델 조직에서 AAV 벡터의 생체내 분포 확인과 transgene mRNA 발현 분석
- 벡터와 transgene expression 양성인 세포의 % 정량 및 시각화
- 세포 특이적인 AAV, neuronal, astrocyte, glia, hepatocyte, Kupfer cell marker등의 세포 마커 probe와 transgene mRNA의 다중 분석
6. Immuno-oncology Research
면역종양학 (Immuno-oncology, IO) 및 암 면역요법 분야는 면역 체크포인트 억제제, 암백신, CAR-T와 같은 치료 접근법에 의해 확장되고 있습니다.
그러나 종양 미세 환경(TME)에서 면역 세포의 기능과 다른 세포 유형의 상호 작용을 이해하는데에는 여전히 제한이 있습니다. TME에서 암 치료를 위한 새로운 표적과 modulator가 계속해서 발견되고 있지만 종양 조직에서 이를 조사할 수 있는 도구는 종종 부족합니다. 면역조직화학법(IHC)이 기존에 주로 이용되는 방법이지만 특이적이고 민감한 항체가 부족하기 때문에 사용이 제한되는 경우가 많습니다.
RNAscope 기술을 사용하면 FFPE(포르말린 고정 파라핀 포매) 조직에서 단일 분자 감도와 높은 특이성으로 체크포인트 및 세포 특이적 마커를 포함한 모든 표적 mRNA의 공동 발현 프로파일을 빠르고 효율적으로 검출할 수 있습니다.
7. Cardiovascular and Skeletal Muscle Research
심장 및 골격근은 여러 세포 유형으로 구성된 복잡하고 이질적인 조직입니다. RNAscope in situ hybridization(ISH) 분석은 심장과 근육 내에서 유전자 발현의 복잡한 공간 구성에 대한 귀중한 자료를 제공합니다. 이는 정상적인 심장 및 골격근 과정뿐만 아니라 심혈관 및 골격근 질환의 발달과 관련된 유전자 및 경로의 발견 및 특성화에 매우 적합합니다. RNAscope 분석은 다양한 심장 및 골격근 세포 유형에서 단일 세포 수준까지 전사체의 (co)localization 및 특성화를 가능하게 합니다.
8. Stem Cell Research
줄기세포의 자가 재생, 분화 및 재프로그래밍 연구를 넘어, 줄기 세포 집단을 밝히고, 줄기 세포 마커를 특성화하고, 줄기 세포에서 분비되는 신호를 확인하려는 연구로 계속 확장되고 있습니다. RNAscope™ ISH(in situ hybridization) 기술을 통해 줄기 세포 집단의 마커에 대한 RNA 전사체의 세포 특이적 국소화를 신속하고 정확하게 관찰할 수 있습니다.
- 줄기 세포 집단 식별, 특성화
- 줄기 세포 유지 및 재생 marker 확인
- 줄기 세포에서 long non-coding RNA 식별
- 신뢰할 수 있는 항체가 없을 때 줄기 세포 marker 감지
9. Inflammation Research
염증은 특히 천식, 관절염, 암, 비만, 심장병, 대장염 및 신경 장애를 포함한 광범위한 질병과 관련이 있습니다. 분비 인자와 그 수용체, 세포 기원 및 기타 바이오마커의 검출은 많은 염증성 질환을 이해, 진단 및 치료하는 데 중요합니다.
RNAscope™ in situ hybridization assay는 조직 환경 내에서 염증성 바이오마커의 검출 및 검증을 위한 매우 신뢰할 수 있고 강력한 방법을 제공하며, 일반적으로 사용 가능한 FFPE 샘플로 수행할 수 있습니다. 염증 관련 연구에서 RNAscope ISH 분석의 적용을 입증하는 여러 연구가 발표되었습니다.
- cytokine 및 cellular origin의 식별
- 염증성 질환에서 long non-coding RNA (IncRNA)의 검출
- 발암 중 염증 경로의 역할 규명
- 염증성 질환에서 분비 단백질의 치료 가능성 확인
- cytokine 검출을 위한 dual ISH-IHC
관련 페이지
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