항체치료제의 평가 분석 case study

Eurofins Discovery사에서 제공하는 항체치료제 

evaluation 적용사례를 소개합니다. 

이 사례에서는 안전성 프로필을 갖춘 시판 의약품인 Trastuzumab (Herceptin)을 이용하여, 약물 개발 및 승인 프로세스의 목표, 대상을 검증하고 최적화 하기 위해 주요하게 필요한 항목과 데이터는 무엇인지, 전임상으로 가기 위한 데이터화 과정 등을 소개합니다. 

CHARACTERIZATION OF THERAPEUTIC ANTIBODIES DURING DRUG DISCOVERY


Trastuzumab은?

Herceptin이라고도 불리며, ErbB2를 타겟으로 하는 humanized monoclonal anitbody입니다. HER2 양성 유방암 치료제로 1998년에 FDA 승인을, 2000년에는 EMA 승인을 받았고, 2010년에는 HER2 양성 위암 치료제로 FDA 허가를 받았습니다. 초기 바이오치료제로서 2019년에 67억 달러를 초과한 매출로 임상적 유용성이 입증되었습니다. 이후 생물학적 제제의 승인은 가속화되고 있고, FDA는 48개의 mAbs를 승인했습니다. 또한 바이오시밀러에 대한 승인도 증가하여, 2017년부터 FDA 승인을 받은 Trastuzumab용 바이오시밀러는 Ogivri®, Herzuma®, Ontruzant®, Trazimera™, Kanjinti™등이 있습니다. 


Eurofins Discovery의 trastuzumab 평가를 위한 실험 디자인

trastuzumab의 평가를 위해 2개의 파트로 나누어 실험을 진행하였습니다. 

파트 1 :  trastuzumab의 포괄적인 특성화를 제공하는 분자적 접근방식 

  1. SPR (Surface Plasmon Resonance)를 이용한 Fc receptor binding assay : FcRn 및 FcgammaRI와 trastuzumab과의 binding affinity 확인
  2. Receptor binding과 receptor occupancy (RO) assay : BT-474 cell에서 trastuzumab의 antibody binding capacity (ABC)를 평가하고 HER2-PE 항체를 이용하여 competition assay 수행
  3. Antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) assay : 세포 독성 확인
  4. Comprehensive in vitro proarrythmia assay (CiPA) assays : 활동전위 지속시간을 증가시킬 수 있는 이온채널 억제 테스트. QT 연장에 대한 biomarker인 field potential duration (FPD)에 대한 효과의 프로파일링  

파트 2 : 생물학적으로 관련된 결과에 대한 통찰력을 제공하는 중개 접근 방식 

  1. Oncopanel Cell-based screening & Profiling service : 세포 증식과 genomic biomarker 확인
  2. BioMAP Phenotypic Screening & Profiling service : 각 disease 모델의 human primary cell과 co-culture를 통해 효능, 안전성, MOA 평가 
  3. LC-MS/MS : In vivo내 약물대사, 약동학 (PK) 확인 
  4. Tumor xenograft model : BT-474, NCI-N87 모델을 이용하여 in vivo efficacy 결정 



평가 결과 

1. SPR (Surface Plasmon Resonance)를 이용한 Fc receptor binding assay

IgG의 Fc 도메인은 면역반응 조절에 중요한 역할을 합니다. ADCC와 식균작용은 특화된 백혈구의 표면에서 발현되는 서로 다른 유형의 Fcgamma 수용체 (FcgR)에 의존합니다. Fc수용체 (FcRn)은 반감기를 연장하는 데 중추적인 역할을 하는 IgG recycling을 조절합니다. 각 FcgR 및 FcRn에 대한 생물학적 기능은 아래 테이블을 참고하세요.


Table 1. Biological functions of Fcγ receptors and neonatal Fc receptor (FcRn)

Biological functions of Fcγ receptors and neonatal Fc receptor (FcRn

SPR (Surface Plasmon Resonance)은 바이오치료제의 분자 결합 이벤트를 평가하는 방법입니다. 고감도, 실시간 모니터링, label-free 검출로 널리 보급되었고, 결합친화도 및 동역학의 특성화, clone 평가, 다양한 제형을 위한 재료 준비 등 항체 개발에 있어 다양한 목적으로 사용됩니다.

SPR Binding 분석은 FDA, EMA, ICH, NMPA등의 규제 기관에서 잘 알려져 있습니다. SPR 분석은 Biocore 8K+기기를 이용하여 임의의 IgG 항체와 모든 9개의 Fc 수용체 사이의 결합 친화도 (KD) 및 결합 동역학 (kon 및 koff)를 측정할 수 있습니다. Fc Receptor Binding Panel (#PP274)는 FcgR 및 FcRn 분석을 제공하는 포괄적인 패널입니다. 

Trastuzumab는 FcgR binding을 통해 강한 면역 반응을 형성하고 항체매개 세포독성 (ADCC)와 식세포의 활성을 유도합니다. Trastuzumab와 9가지 Fc receptor와의 binding affinity는 Table 2에 요약되어 있으며, Fc Receptor Binding Panel (Item #PP274)을 이용한 분석결과는 다음과 같습니다. 

Binding affinity of trastuzumab with FcRn and FcγRI
Figure 1. Binding affinity of trastuzumab with FcRn and FcγRI. Validation of the Fc Receptor Binding Panel (Item #PP274) and trastuzumab was conducted for all Fc receptors in Table 1. A. FcRn-trastuzumab SPR binding sensorgrams and B. affinity plot at pH 6.0. The steady state relative response (RU) in sensorgrams against each concentration is depicted to obtain an affinity plot. The affinity plot was fitted by Langmuir model to obtain the KD. Binding affinity between trastuzumab and FcRn is about 10-7 M. FcRn is known for its ability to protect antibodies from lysosomal degradation and therefore improves the half-life of antibody in circulation. C. FcγRItrastuzumab SPR binding sensorgrams with kinetics fitting. Sensorgrams were fitted with the kinetics model to obtain the ka , kd and KD. FcγRI showed the strongest binding (10-9 M range) among the nine Fc receptors. SPR sensorgrams and affinity plots for the remaining Fc receptors are not shown.


2. Receptor Binding & Occupancy 

수용체 점유(RO) 분석은 유세포 분석법으로 진행되며, 바이오치료제의 표적에 대한 PK/PD 매개변수 및 작용기전(MOA)를 이해하고 안전성 및 효능을 평가하는데 도움이 됩니다. 표면 수용체 측정, 내재화 또는 shedding event 등 실험 목적에 따라 다양한 정성, 정량적 실험법을 제공합니다.

아래의 데이터는 BT-474 유방암종 세포주에서 Trastuzumab 항체의 결합능력(ABC)을 평가하고 RO 및 HER2-PE 항체를 이용한 경쟁분석을 보여줍니다. 

evaluation of trastuzumab antibody binding capacity


3. Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC) Assay

ADCC 분석은 특히 oncology 적용 분야에서 바이오치료제의 MOA를 평가하는데 널리 사용됩니다. 이들은 다양한 표적 세포 및 effector cell 매커니즘에 대한 MOA를 평가하는데 효과적입니다. 검증된 anti-HER2 ADCC 분석 (#300230-1)은 3가지 donor로부터 얻은 PBMC effector cell과 함께 BT-474 target cell을 사용합니다. PBMC donor 조건은 맞춤형으로 제공될 수 있습니다. Eurofins Discovery에서는 oncology 외에도 다양한 치료 영역에 적합한 맞춤형 ADCC 분석법을 개발해 드립니다. 

Flow cytometry assessment of HER2 surface expression on three breast cancer cell lines


ANTI-HER2 ADCC ASSAY


4. In Vitro Proarrythmia Assay (CiPA)
Eurofins Discovery는 ion channel high-throughput (HT) 연구 프로토콜, 지침, 권장사항 및 연구 검증 데이터를 CiPA (Comprehensive in vitro Proarrythmia Assay) initiative에 제공하였습니다. CiPA initiative는 인간 심실 활동 전위의 in silico 모델링과 인간 줄기세포유래 심실 심근세포(cardiomyocyte)에서 얻은 in vitro data를 사용하여 다양한 심장 이온 전류에 대한 약물 효과를 통합함으로써, 향상된 정확도를 통해 신약의 부정맥 유발 위험을 평가하는데 도움을 줍니다. CiPA는 시판 치료제에 대한 임상 약물 개발 및 약물 라벨링에서 ECG monitoring 결정에 영향을 미칠 수 있는 추가 정보를 제공합니다. 

1) Voltage-gated Ion Channel Studies
  • Voltage gated sodium: Nav1.5 (Peak), Nav1.5 (Late, Antagonist), Nav1.5 (Late, Agonist)
  • Voltage gated potassium: Kv4.3/KChIP2, hERG, KCNQ1/minK
  • Voltage gated calcium: Cav1.2
  • Inward rectifying voltage gated potassium: Kir2.1

Assessment of cardiac safety using the CiPA Panel

Assessment of cardiac safety using the CiPA Panel-2

 Assessment of cardiac safety using the CiPA Panel indicates trastuzumab has limited potential for disruption of cardiac action potentials. A-H. Ion channels were tested with increasing concentrations of trastuzumab and IgG1 (1.97, 5.93, 17.77, 53.33 and 160 μg/ mL) together with their respective positive controls. Positive controls (purple triangles) were selected to determine the sensitivity and specificity of the respective channels. Time-matched vehicle controls (dotted line) were used to test the stability of each assay. The results indicate trastuzumab and IgG1 did not inhibit any ion channel currents.

 

2) MEA Assay with Trastuzumab

trastuzumab과 isotype control IgG1이 자발적으로 박동하는 hiPSC 유래 Cardiomyocyte의 세포외 필드전위 (FP)에 미치는 영향에 대해 MEA 분석을 수행하였습니다. 1차 목적은 생체내 QT 연장을 나타내는 시험관내 매개변수인 Field Potential Duration (FPD)를 연장하는지 여부를 테스트 하는 것이었습니다. reference control인 diltiazem과 mexilentine을 사용한 데이터는 MEA가 재분극 전류의 지연을 감지할 수 있음을 보여줍니다.  trastuzumab은 spike간 간격, 필드전위 지속시간, 보정된 필드전위 지속시간, Na+ spike 진폭을 억제하지 않았습니다. 즉 trastuzumab이 in vivo QT 연장에 대한 in vitro 실험에서 FPD, FPDc에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냅니다. 


MEA assays

출처: CHARACTERIZATION OF THERAPEUTIC ANTIBODIES DURING DRUG DISCOVERY
(파트2는 차후 업데이트 됩니다.)


관련 서비스 



항체치료제 서비스 문의 : 고마바이오텍(주) (02-579-8787)