siPOOL(siRNA pool) FAQ
RNA 간섭(RNAi)은 유전자 기능을 결정하기 위한 유전자 침묵 도구로 널리 사용됩니다. 이것은 적용이 용이하고, 광범위한 세포 유형에 적용할 수 있으며, 처리량에 따른 결과를 볼 수 있어 약물과 유사한 특성을 가지며 빠른 시간 안에 결과를 볼 수 있다는 장점이 있기 때문입니다. 그러나, 합성 RNAi 매개체, short interfering RNAs (siRNAs)가 광범위한 비표적 효과 (off-target effect)를 생성할 수 있다는 것이 널리 알려져 있고, 이로 인해 매우 가변적인 결과가 발생하여 여러 siRNA 시약을 사용하여 검증하기 위한 노력이 필요하며 비용과 시간이 소요됩니다.
siRNA 비표적화로 인한 위양성 결과를 감지하지 못한 경우 상당한 비용이 발생할 수도 있습니다. siPOOL은 단일 유전자에 대해 최적으로 설계된 30개의 siRNA로 구성된 복잡한 풀입니다. 높은 복잡성 풀링 (high complexity pooling)은 개별 siRNA의 농도를 줄여 siRNA 특정 오프 타겟 효과를 희석합니다. 대조적으로, siPOOL이 제공하는 더 큰 전사 범위로 인해 표적 유전자 knock-down 효율이 증가합니다. 그 결과, 기능 상실 표현형 (loss-of-function phenotype)이 더욱 강력해지고 재현 가능해집니다. siPOOL 구조 구조는 또한 유전자 기능을 복원하기 위해 효율적으로 작동하는 것으로 입증되었습니다.
siPOOL은 유전자 기능을 빠르고 안정적으로 확인하는 이상적인 도구이며 고처리량 RNAi 기반 스크리닝에 사용하여 다양한 세포 기반 시스템에서 새로운 표적을 식별할 수 있습니다.
1. siPOOL은 어떻게 유전자 knockdown의 특이성과 효율성을 증가시키나요?
siPOOL은 30개 정도의 siRNA로 구성된 높은 복잡한 pooling을 사용하여 각 siRNA의 오프 타겟 효과를 관련성이 없다고 판단할 수 있는 정도로 희석합니다. 독점 siPOOL 설계 알고리즘은 최대 전사 범위와 paralog 방지를 보장하여 각각 유전자 녹다운 효율성과 특이성을 높입니다. 특허받은 siPOOL 생산 방식은 정의된 길이와 최고 순도 표준의 siRNA를 생성하여 비특이적 효과의 위험을 최소화합니다.
2. siPOOL과 시중에서 판매되는 다른 siRNA pool의 차이점은 무엇인가요?
상업적으로 이용 가능한 다른 siRNA pool은 3-4개의 siRNA로 단순하게 제작되고, 다양한 길이의 siRNA로 구성된 확률론적 풀입니다. 대조적으로, siPOOL은 신중하게 선택되고 정의된 길이의 siRNA로 구성된 pool입니다.
3. siPOOL로 제작 가능한 최소 시퀀스 길이는 얼마인가요?
300개 이상의 염기서열도 종종 siPOOL 설계에 충분합니다. siRNA 사이의 어느 정도의 서열 중첩은 seed 서열의 다양성이 유지되는 조건에서 문제가 되지 않습니다.
4. siPOOL 제작 시 어떤 점을 보장하나요?
코딩 유전자에 대한 모든 siPOOL은 유효성 검사에 대한 보증이 적용됩니다. siPOOL이 최대 10nM의 농도로 적용되고 RNA가 24시간 후에 정량화 될 때 ≥ 70% knockdown이 보장됩니다. 최적의 transfection 조건은 주어진 표적이 발현되는 표준 세포주에서 양성 대조군 siRNA로 확인되어야 합니다. ≥ 70% knockdown이 보이지 않으면 사용 가능한 순서에 따라 새로운 siPOOL의 재설계, 재합성, 검증을 무료로 수행합니다. Knock-down 효율 또한 유전자 특성에 따라 달라지므로 새로운 siPOOL로 Knock-down 효율 향상을 보장할 수 없습니다.
non-coding gene에 대한 siPOOL의 경우, 60% 이상의 녹다운이 달성되지 않으면 사용 가능한 서열에 따라 재합성이 수행됩니다.
5. Long non-coding RNA에 대한 검증이 포함되지 않은 이유는 무엇인가요?
RNAi로 long non-coding RNAs (lncRNA)를 침묵시키는 것은 2차구조, 결합단백질, 세포국소화에 의한 접근의 한계 등으로 더 어렵습니다. 사용 가능한 전사체 서열을 참고하여 lncRNA의 다른 영역을 대상으로 하는 siPOOL을 재설계하고 합성을 수행합니다. 그러나 siPOOL의 검증은 연구 중인 lncRNA의 속성을 잘 알고 있는 연구자에 의해 수행되는 것이 가장 좋습니다.
6. siPOOL은 핵에 국한된 RNA에 대해서만 작동하나요?
RNAi machinary는 핵에 존재하는 것으로 보고되었으며 핵에 국한된 RNA(예: MALAT1, XIST)에 대한 일부 siPOOL은 70% 이상의 knockdown 효율로 작동했습니다. 그러나 세포질에 국한된 RNA는 RNAi에 의해 보다 효율적으로 표적화 될 것으로 예상됩니다.
7. siPOOL을 결합하여 동시에 여러 유전자를 녹다운할 수 있나요?
예. siPOOL은 낮은 nanomolar 농도에서 효율적입니다. 이를 통해 여러 siPOOL을 단일 응용 프로그램에 결합하여 부작용 위험을 최소화하면서 여러 유전자를 침묵시킬 수 있습니다.
아래의 논문에서 최대 4개의 유전자가 siPOOL과 함께 성공적으로 침묵된 사례를 확인할 수 있습니다.
Welsbie, D. S. et al. Enhanced Functional Genomic Screening Identifies Novel Mediators of Dual Leucine Zipper Kinase-Dependent Injury Signaling in Neurons. Neuron 94(6), 1142–1154.e6 (2017)
8. siPOOL 사용 농도는 얼마나 되나요?
표준 세포주(예: HeLa, Hek293, A549, MCF7)에서 siPOOL은 일반적으로 Lipofectamine transfection 시약과 함께 1-3nM에서 적용됩니다. transfection하기 어려운 세포에서는 더 높은 농도가 필요할 수 있으며 electroporation과 같은 대체 방법이 적용될 수 있습니다. 녹다운 효율이 정체되는 최저 농도를 결정하기 위해 용량 적정 곡선을 수행하는 것이 좋습니다. 장기 유전자 녹다운(> 3일)의 경우 더 높은 초기 siPOOL 농도가 권장됩니다. 용량 반응 최적화 서비스는 siTOOLs Biotech에서 제공하며 7점 용량 적정 곡선을 수행합니다.
9. siPOOL을 이용한 silencing은 얼마나 오래 지속되나요?
siPOOL silencing 기간은 다른 siRNA와 유사하며 세포주와 표적 유전자에 따라 다릅니다. 유전자 침묵은 일반적으로 4-7일 동안 지속될 수 있습니다. 증식률이 높거나 활성이 높은 유전자를 가진 세포는 RNAi 매개 침묵의 지속 시간이 더 짧을 수 있습니다. 침묵 기간을 연장하기 위해 siPOOL의 re-transfection 또는 초기 transfection시 더 높은 농도를 이용하여 수행할 수 있습니다.
10. siPOOL은 특정 isoform을 대상으로 할 수 있나요?
siPOOL은 높은 특이성과 효율성으로 선택된 isoform을 성공적으로 표적화했습니다. 그러나 성공여부는 isoform에 고유한 시퀀스 가용성에 따라 달라집니다. NCBI ID를 보내주시면 확인해 드립니다. 교차 동형/종 선택성 siPOOL 검증 서비스도 제공됩니다.
11. 음성 대조군 siPOOL은 무엇을 이용하나요?
인간, 마우스 및 쥐 유전자와 상호 작용하지 않는 표준 음성 대조군 siPOOL(30개의 siRNA)을 사용합니다. 그것은 여러 세포주에서 테스트되었으며 세포 증식, 세포 사멸 또는 세포 형태에 큰 영향을 미치지 않습니다. Scrambled negative control siPOOL은 요청 시 표적 siRNA 서열이 뒤섞여 표적 상호 작용을 피하면서 %GC 함량을 유지하는 경우에도 제공될 수 있습니다.
12. 양성 대조군 siPOOL은 무엇을 이용하나요?
양성 대조군 siPOOL은 사전 검증된 siPOOL로, 세포에 도입될 때 성공적인 transfection을 나타냅니다. 이용 가능한 양성 대조군 siPOOL에는 유사분열 정지 및 관찰 가능한 세포 사멸을 일으키는 인간 KIF11(3832)에 대한 siPOOL과, 현미경으로 관찰할 수 있는 확대된 세포를 생산하는 human INCENP(3619), 관찰 가능한 표현형을 생성하지 않지만 GAPDH RNA를 크게 감소 시키는 human GAPDH(2597)이 포함됩니다. mouse Gapdh(14433) 및 Kif11(16551)에 대한 양성 대조군 siPOOL도 사용할 수 있습니다.
13. siPOOL은 인간, 마우스 및 쥐 이외의 다른 종을 타겟팅하여 제작할 수 있나요?
예, siPOOL은 모든 종을 대상으로 만들 수 있습니다. 대상 종, 숙주 시스템 및 대상 서열을 알려주시면 제작이 가능합니다.
14. transfection 조건이 siPOOL 및 기타 siRNA 시약과 다른가요?
아니요, siRNA에 대해 동일한 최적화된 transfection 조건을 siPOOL에 적용할 수 있습니다.
15. transfection 시약을 추천해 줄 수 있나요?
상업적으로 이용 가능한 광범위한 transfection 시약이 있습니다. 많은 일반적인 세포주에서 Lipofectamine은 매우 잘 작동합니다. 그러나 1차 대식세포 또는 비부착 세포와 같은 세포 유형의 transfection은 더 많은 문제를 제시합니다. siTOOLs Biotech은 제공된 세포주에서 3가지 형질 감염 방법을 테스트하는 형질 감염 최적화 서비스를 제공합니다. 자세한 내용은 문의주세요.
16. siPOOL의 유통기한은 어떻게 되나요?
siPOOL은 -20°C에서 보관할 때 최소 6개월 동안 안정적이지만 몇 년 후에도 siPOOL 활동이 관찰되었습니다. 다중 동결 해동 주기를 피하기 위해 더 큰 부피를 여러 vial에 소분하는 것이 좋습니다.
17. siPOOL을 공개된 검증 방식으로 사용할 수 있나요?
예, siPOOL은 일상적으로 유전자를 침묵시키는 데 사용될 뿐만 아니라 CRISPR, 단일 siRNA 또는 shRNA와 같은 다른 기술로 식별된 유전자에 대한 검증 접근 방식으로도 사용됩니다. "siTOOLs Biotech" 및 당사 논문 Hannus et al., Nucleic Acids Res, 2014를 인용하세요.
18. siPOOL을 추가로 검증할 수 있는 방법이 있나요?
예. siPOOL 결과의 추가 검증은 siPOOL 저항성 버전의 유전자가 발현되어 기능을 복원하는 구조 구성 (rescue construct)으로 수행할 수 있습니다.
19. siRNA를 개별적으로 테스트하기 위해 siPOOL을 분리해야 하나요?
siPOOL을 deconvolution하는 것을 권장하지 않습니다. 이는 높은 복잡성 풀링에 의해 부여된 높은 특이성을 파괴할 수 있기 때문입니다. siPOOL 결과를 추가로 검증하려면 siPOOL-resistant rescue constructs를 사용하는 것이 좋습니다.
20. 기능적 게놈 스크리닝에 siPOOL 라이브러리를 사용할 수 있나요?
예. 신뢰할 수 있는 RNAi 파생 히트를 얻기 위해 고처리량 기능 게놈 스크리닝에 사용할 수 있는 505개의 siPOOL이 포함된 siPOOL 인간 kinase library가 있습니다. 이외에도 E3 ligase, Kinase, RNA-binding protein, Ubiquitinase, GPCR 유전자에 대한 siRNA POOL(siPOOLs)를 full panel로 제공합니다.
21. siPOOL로 얼마나 많은 반응을 실행할 수 있나요?
siPOOL은 표적 유전자당 5, 10 또는 20nmol로 제공됩니다. 1nM의 siPOOL 농도에서 5nmol은 6well 플레이트의 최소 2250개 well, 또는 96well 플레이트의 45000개 well에 사용할 수 있습니다.
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