탈아미노기 효소 기반 크로마틴 footprinting: DAF-seq, ACCESS-ATAC 및 최신 기술 소개
단 하나의 C-to-T 전환으로 단분자 에피게노믹스 혁신하기
유전자의 조절 방식은 정상적인 발달부터 질병에 이르기까지 모든 것을 결정합니다. 정상적인 유전자 조절은 인핸서(enhancer)나 프로모터(promoter)처럼 선형 DNA 상에서 수 kilobase 떨어져 있을 수 있는 핵심 요소들에 여러 단백질이 조율되어 결합함으로써 통제됩니다.
기존의 절단 기반 분석법(MNase-, DNase I-, ATAC-seq)은 단백질이 결합된 DNA가 보호된다는 점을 이용해 접근 가능한 DNA 영역을 확인해왔습니다. 그러나 이러한 방법들은 동일한 개별 DNA 가닥 상에서 일어나는 다중 결합 이벤트를 연결하지 못하는 한계가 있었습니다. 최근 등장한 DNA 메틸전이효소 기반 방법들(Fiber-seq, SAMOSA 등)은 DNA 가닥을 보존하여 개별 가닥의 공동 결합을 감지할 수 있지만, PCR과 호환되지 않아 상당한 양의 시작 물질(starting material)이 필요합니다.
이러한 한계를 극복하기 위해, 이중쇄 DNA 탈아미노기 효소(dsDNA deaminase)를 기반으로 한 접근성 매핑 방법들이 에피게노믹스 분야에서 큰 주목을 받고 있습니다.
탈아미노기 효소 기반 크로마틴 footprinting의 작동 원리
• 표지 방식: 탈아미노기 효소 기반 방법에서는 세포핵을 비특이적 dsDNA 탈아미노기 효소와 함께 배양합니다.
• C-to-T 전환: 이 효소는 접근 가능한 시토신(cytosine)을 우라실(uracil)로 변환하며, 이는 이후 PCR 과정에서 U-to-T로 전환되어 C-to-T 전환(또는 반대쪽 가닥의 G-to-A 전환)을 일으킵니다.
• 보호된 영역: 전사 인자(TF)나 뉴클레오솜에 감긴 DNA에 의해 결합된 시토신은 탈아미노화로부터 보호됩니다.
• 데이터 해석: 시퀀싱 후, 이러한 C-to-T 돌연변이는 열려 있거나 보호되지 않은 DNA로 해석되며, C-to-T 돌연변이가 없는 DNA 구간은 TF 또는 뉴클레오솜이 결합된 위치로 유추됩니다.
주요 롱리드(Long-read) 탈아미노기 분석법
롱리드 시퀀싱은 탈아미노기 효소의 비파괴적 특성을 활용하여 관심 있는 유전체 영역을 수십 킬로베이스에 걸쳐 시퀀싱합니다.
• DAF-seq: PacBio HiFi 기기에서 표적형 단분자 크로마틴 파이버 시퀀싱을 수행하기 위해 SsDddA를 사용합니다. PCR 증폭과 호환되며, 실행당 최대 100개 렉스(100-plex) 멀티플렉싱이 가능하고, scDAF-seq를 통해 염색체 규모의 단일 세포 접근성 맵을 생성할 수 있습니다.
• TDAC-seq: 풀링된 CRISPR 스크리닝에 탈아미노기 효소 크로마틴 프로파일링을 결합한 방법입니다. DddA11 및 MGYFPDa829 효소를 사용해 동일한 단일 DNA 파이버에서 유전적 교란과 주변 크로마틴 구조를 동시에 읽어냅니다.
주요 숏리드(Short-read) 탈아미노기 분석법
• 숏리드 탈아미노기 방법들은 일루미나(Illumina) 같은 널리 보급된 숏리드 플랫폼과 호환되도록 ATAC-seq 워크플로우를 기반으로 발전했습니다.
• FOODIE: Tn5로 DNA를 태그멘테이션(tagmentation)한 후 DddB 또는 MGYFPDa829를 이용해 탈아미노화를 수행하여 고해상도 접근성 및 TF 푸트프린팅 맵을 생성합니다.
• ACCESS-ATAC: 세포핵을 탈아미노기 효소(DddA 또는 DddSs)와 Tn5로 동시에 또는 순차적으로 처리하며, 동시 처리가 가장 최적의 결과를 낳는 것으로 나타났습니다.
• cFOOT-seq: 탈아미노기 효소 SsdAtox를 전장 게놈 시퀀싱(WGS)과 결합하여 전 유전체에 걸쳐 TF 푸트프린팅을 포착하며, 기존 ATAC-seq 및 scATAC-seq 파이프라인과 호환됩니다.
• D&D-seq: 항체 또는 나노바디에 결합된 탈아미노기 효소를 사용하여 특정 단백질의 DNA 상호작용을 기록합니다 (참고용으로 포함된 특수 목적 방법).
맺음말
탈아미노기 효소 기반 매핑 방법은 기존의 절단 기반 접근법에 비해 우수한 푸트프린팅 해상도를 제공합니다. 비파괴적 방식으로 DNA를 표지하고 PCR 증폭을 견뎌내기 때문에 메틸화 기반 방법보다 적은 양의 샘플로도 작업이 가능합니다. 또한 롱리드 시퀀싱과 결합할 경우 단분자 해상도로 동일한 DNA 분자 상에서 여러 단백질의 공동 결합을 해결할 수 있습니다.
최근 EpiCypher 등에서 관련 효소와 시약(IDEA Toolbox의 SsDddA 및 억제제 SsDddI 등)을 상용화함에 따라, 이러한 혁신적인 기술을 연구실에 도입하고 응용하는 장벽이 크게 낮아지고 있습니다.
[관련 제품]
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