MULTISCREEN™ Beta Arrestin 센서 기술 : 변형되지 않은 GPCR의 biased 세포 신호 전달에 대한 고처리량 검출
베타-어레스틴(Beta-arrestin)은 수용체 탈감작(desensitization)을 통해 GPCR(G 단백질 연결 수용체)의 신호 전달 및 이동(trafficking) 조절에 관여하는 단백질 계열로, 빛에 민감한 화합물부터 호르몬 및 신경전달물질에 이르기까지 아주 다양한 리간드에 의해 활성화될 수 있습니다. 외부 신호에 의해 GPCR이 활성화되면, 이질삼량체 G 단백질(heterotrimeric G protein)과의 상호작용을 통해 단백질이 활성화되고 신호 전달 캐스케이드(signaling cascade)가 시작됩니다. 그러면 수용체는 G 단백질 연결 수용체 키나아제(GRKs)에 의해 인산화되어(phosphorylated) 너무 길거나 부적절한 신호 전달을 막아주는 동시에, 베타-어레스틴 같은 단백질이 딱 달라붙도록 수용체를 표시해 줍니다.
베타-어레스틴은 인산화된 수용체에 달라붙어서, G 단백질과의 상호작용을 방해함으로써 GPCR 활동을 더욱 억제하고 동시에 수용체가 세포 안으로 쏙 들어갈 수 있도록 표시를 해줍니다(내재화, internalization). 이런 상호작용 덕분에 활성화된 수용체가 세포 표면에서 사라져서 외부 신호에 대한 세포의 반응이 약해집니다(dampening).
베타-어레스틴은 신호 전달 경로 자체에도 참여하는데, 다른 신호 전달 단백질들을 모아서 스캐폴드(scaffold)처럼 작용하고 G 단백질과는 상관없이 다른 경로를 시작시키기도 합니다. 시각 어레스틴(visual arrestins)과 원추 어레스틴(cone arrestins) 같은 다른 형태의 어레스틴도 있는데, 이는 특히 빛에 대한 광수용체 세포의 빠르고 정교하게 조절되는 반응에 특화되어 있습니다.
살아있는 세포에서 베타-어레스틴을 연구하는 것은 GPCR과의 상호작용을 이해하는 데 정말 중요합니다. 세포 간의 소통과 단백질 네트워크에 대한 더 깊은 이해를 제공하고, GPCR 활동이 이상해진 다양한 질병에서 치료 타겟으로서의 잠재력을 보여주기도 합니다.
최근 몇 년간 GPCR 신호 전달이 G 단백질 경로와 어레스틴 경로로 나뉘는 현상(bifurcation)은 타겟 관련 병인학에 대한 학계 및 제약 연구 분야에서 관심사가 되었습니다. 특정 GPCR 신호 전달 경로만 골라서 활성화하거나 억제하는 화합물을 설계할 수 있는 가능성이 생기면서 부작용 없이 효과 좋은 치료법을 찾는 데 대한 새로운 희망을 약물 발견 전문가들에게 안겨주었습니다.
왜 MULTISCREEN™ 베타 어레스틴 센서 기술인가?
GPCR 베타-어레스틴 신호 전달을 측정하기 위해 여러 확립된 기술들이 있었습니다. 고처리량 스크리닝에 사용될 수 있는 이러한 구형 스크리닝 분석법들은 모두 GPCR을 C-말단에서 세포 내에서 효소, 효소 단편 또는 형광 단백질로 태깅하는 것을 요구합니다. GPCR의 C-말단은 어레스틴 결합과 G 단백질 결합에 사용되는 기능 도메인이기 때문에, 이러한 상당한 크기의 단백질 태그는 단백질-단백질 상호작용을 변경함으로써 수용체 신호 전달에 편향을 유발하고 실험 결과 분석을 어렵게 만들 수 있습니다.
더욱이, 일부 연구에서는 G 단백질 경로 분석을 위해 변형되지 않은 GPCR을 가진 한 세포주를 사용하고, 어레스틴 분석을 위해 다른 세포주에서 태그가 부착된 수용체를 사용하는 방식을 택하기도 합니다. 이러한 접근 방식은 타겟 GPCR에 의해 유발되는 세포 신호 전달과는 무관한 다른 세포주로부터 발생하는 원치 않는 편향을 추가로 도입합니다. 마지막으로, 구형 스크리닝 분석법에서 요구되는 GPCR 태깅은 내인성(endogenous) GPCR 연구를 완전히 불가능하게 만듭니다. 이러한 한계를 극복할 필요성이 Multispan의 MULTISCREEN™ 기술의 탄생으로 이어졌으며, 이 기술은 변형되지 않은 GPCR에 의한 베타-어레스틴 동원(recruitment)을 측정하기 위해 특별히 설계되었습니다.
유효한 약물 후보 물질 식별 및 최적화 개선
예시 :
한 학술 연구실에서 베타-어레스틴 세포 신호 전달 경로에 있는 몇몇 도구 분자에 대해 학술 발표에 사용할 만한 수준의 데이터를 확보해야 하는 상황입니다. 연구실에 이미 있는 구형 베타-어레스틴 기술 대신, 그들은 수용체의 약리학적 특성을 왜곡할 수 있는 태깅을 피하기 위해 우리의 새로운 MULTISCREEN™ 베타-어레스틴 센서를 사용하여 분자들을 조사하기로 선택합니다. 이 연구실은 이미 cAMP 분석법으로 검증된 GPCR을 발현하는 안정적인 세포주를 가지고 있으므로, MULTISCREEN™ 베타-어레스틴 BacMam 분석 키트만 구매하면 됩니다. 세포 배양액에 바이러스 입자를 추가하기만 하면, 24-48시간 후에 키트에 포함된 기질을 사용하여 수용체를 변형할 필요 없이 하나의 세포주에서 두 가지 신호 전달 경로를 모두 측정할 수 있게 됩니다. 이 분석법은 시약을 섞고 읽기만 하면 되는(mix-and-read) 방식이며, 세척 단계가 없고(no-wash) 균일합니다(homogeneous). 전체 소요 시간은 30분이며, 직접 작업하는 시간은 10분 미만입니다. 동일한 바이러스 전달 분석 키트는 일차 세포(primary cells)에도 유사한 목적으로 적용될 수 있습니다. 만약 학술 연구실이 자신들이 타겟하는 GPCR을 발현하는 세포주가 없는 경우, Multispan에서 GPCR과 베타-어레스틴 센서를 모두 발현하도록 분열이 멈춘 세포(division-arrested cells)를 구매하거나, GPCR 타겟만 발현하는 세포에 베타-어레스틴 BacMam 분석 키트를 함께 구매할 수도 있습니다. 이러한 모든 해결책은 빠르고 편리하며 표준 시약 가격으로 합리적인 가격대이므로 학술 연구 예산에 적합합니다.
이와 대조적으로, 미발견 GPCR(orphan GPCR)을 연구하는 제약회사는 완전히 다른 상황의 예시가 될 수 있습니다. 알려진 생물학적 정보가 매우 적기 때문에, 당사의 전문가 팀이 초기 단계부터 관여하여 일시적 형질전환(transient transfection)을 사용하여 베타-어레스틴 및 cAMP 경로 모두에서 해당 수용체를 연구할 것입니다. 이러한 초기 결과를 바탕으로, 미발견 GPCR과 베타-어레스틴 센서를 모두 함께 발현하는 안정적인 세포주를 생성하고 선택할 것입니다. 기준 활성 수준에 따라 대체 리간드 스크리닝에 사용할 최적의 클론을 결정하고, HTS(고처리량 스크리닝) 캠페인을 수행할 것입니다. 대체 리간드 후보 물질은 화합물 선도 물질 최적화를 위한 최적의 클론을 선택하기 위해 다른 클론에서도 추가로 연구될 수 있습니다. Multispan의 분석 전문성에 기반한 서비스와 결합된 MULTISCREEN™ 베타-어레스틴 센서는 미발견 GPCR의 생물학적 특성을 해독하고, 아직 활용되지 않았지만 약물 개발 가능성이 매우 높은 이러한 신비한 수용체들을 활용하여 새로운 치료제를 발견하는 강력한 도구가 될 수 있습니다.
작동 원리
MULTISCREEN™ 기술은 두 가지 융합 단백질을 포함하는 바이시스트로닉(bicistronic) 포유류 발현 벡터를 사용합니다 :
- N-말단 루시페라아제 단편과 융합된 베타-어레스틴
- C-말단 루시페라아제 단편과 융합된 막 앵커(membrane anchor) 단백질
MULTISCREEN™ 센서와 내인성(세포 내 원래 있는) 또는 외인성(외부에서 주입한) 변형되지 않은 GPCR 타겟을 함께 발현하는 세포에서, GPCR이 그 작용제(agonist)에 의해 활성화되면 어레스틴이 세포막에 있는 GPCR로 이동하게 됩니다(recruitment). 이 두 융합 단백질이 가까워지면 루시페라아제 상보성(complementation)을 통해 전체 루시페라아제 효소 활성이 재구성되고, 이는 발광 기질(luminescence substrate)을 통해 감지될 수 있습니다. 이 신호는 표준 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 편리하게 읽을 수 있습니다.
MULTISCREEN™ 베타-어레스틴 센서 기술에 쉽게 접근할 수 있도록, Multispan은 학계 및 산업계의 약물 발견 분석 요구사항을 위한 완벽한 솔루션을 제공합니다. 이 포트폴리오에는 세포 감염을 위한 바이러스 전달 도구, 분석 시약, 재조합 안정 세포주, 그리고 화합물 스크리닝 서비스가 포함됩니다.
MULTISCREEN™ 안정 세포주
이 기술을 사용하여, 우리는 다양한 GPCR에 대한 HTS(고처리량 스크리닝) 분석 준비가 된 안정 세포주를 생성할 수 있었습니다. 예를 들어, 우리는 4가지 오피오이드 수용체 모두에 대한 안정 세포주를 개발했습니다. 특히, MOR(뮤 오피오이드 수용체) 안정 세포주에서 발현된 MULTISCREEN™ 센서는 슈퍼 작용제(super agonist)인 DAMGO, 완전 작용제(full agonist)인 모르핀(Morphine), 그리고 부분 작용제(partial agonist)인 부프레노르핀(Buprenorphine)의 효능을 명확하게 구분했습니다. 또한, MOR 베타-어레스틴 동원(recruitment) 분석법은 고품질 고처리량 스크리닝에 적합한 0.7 이상의 Z' 값을 나타냈습니다.
하나의 웰에서 두 가지 분석 (Two Assays in One Well)
베타-어레스틴 및 cAMP 신호 전달 동역학 및 분석 결과 판독 방식의 차이를 활용하여, 우리는 동일한 세포주와 동일한 웰에서 두 가지 분석 모두에 대한 고처리량 및 다중화된 스크리닝 방법을 개발했습니다. 아래 MULTISCREEN™ MOR 안정 세포주에서 얻은 용량-반응 곡선은 이러한 다중화된 분석 형식으로부터 생성되었습니다 : 베타-어레스틴 발광 분석법을 먼저 판독한 후, TR-FRET cAMP 분석법을 두 번째 판독 값으로 사용했습니다.
"하나의 웰에서 두 가지 분석"은 well간의 추가적인 변수 하나를 제거함으로써 신호 편향(signaling bias) 화합물 프로파일링 시 MULTISCREEN™ 기술에 추가적인 장점을 제공합니다. 고품질 데이터 외에도, "하나의 well에서 두 가지 분석"은 세포, 배지, 플레이트 및 소모품과 관련된 시간과 재료 비용을 50% 절감해 줍니다.
BacMam
GPCR과 베타-어레스틴을 함께 발현하는 MULTISCREEN™ 안정 세포주를 사용하는 것 외에도, 재조합 또는 내인성(native) 세포에서 센서의 강력한 일시적 발현을 가능하게 하는 독자적인 BacMam 바이러스 발현 벡터를 개발했습니다. 이 방법은 다양한 기존의 일시적 형질전환(transient transfection) 방법보다 더 간단하고, 비용이 저렴하며, 빠르고, 세포에 더 순하다는 것이 입증되었습니다. 예를 들어, MULTISCREEN™ MRGX2 안정 세포주는 베타-어레스틴1 및 베타-어레스틴2 BacMam 바이러스 입자로 유전자 도입(transduced)되었고, 48시간 후 MULTISCREEN™ 동원(recruitment) 분석법에서 강력하게 분석되었습니다.
재조합 또는 일차 세포에서 내인성(Native) GPCR을 위한 최초의 HTS 베타-어레스틴 분석법
- GPCR 태깅 불필요 – 진짜 수용체의 약리학적 특성을 평가할 수 있습니다.
- 세척 과정 없는(No wash), 균일한(homogeneous) 분석법 (96- 또는 384-웰 마이크로플레이트 형식으로 사용 가능)
- 일시적 또는 안정적으로 형질전환된 세포 모두에서 완벽하게 검증되었습니다.
- GRK2 공동 형질전환(co-transfection)이 필요 없습니다.
- 분석 키트, 시약, 세포주, 서비스 형태로 다양하게 제공됩니다.
향상된 효능 및 안전성 프로필을 갖춘 후보 물질 개발
어레스틴 매개 신호 전달의 중요성이 커지고 GPCR 생리 기능에서 편향된 신호 전달(biased signaling)의 역할이 부각되면서, 강력한 베타-어레스틴 분석법이 GPCR을 타겟으로 하는 약물 개발의 핵심적인 부분이 되었습니다.
1세대 분석법은 관심 있는 GPCR과 베타-어레스틴 모두를 융합 단백질로 태깅하여, 이들이 함께 모였을 때 빛을 생성하는 방식에 의존했습니다. Multispan의 독자적인 MULTISCREEN™ 센서 기술은 변형되지 않은 GPCR을 사용하므로, 1세대 기술의 수용체 태깅 단점을 극복하여 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 내인성(native) GPCR에 의해 유도되는 베타-어레스틴 이동(translocation)을 고처리량으로 검출할 수 있습니다.
차세대 GPCR 분석법 선도
당사의 분석법은 GPCR 자체 대신 베타-어레스틴과 막 센서에 태그를 부착한다는 점에서 독특하며, 베타-어레스틴의 이동(translocation)을 분석 결과 판독에 활용합니다. 이러한 접근 방식은 태그가 부착된 어레스틴과 막 센서 간의 더 가까운 근접성을 촉진하여 기능적인 루시페라아제 효소 반응을 시작시킵니다.
GPCR 태깅을 피함으로써 관련 단점을 회피하며, 내인성 또는 미발견(orphan) GPCR에서 베타-어레스틴 활성을 연구하는 실행 가능한 방법을 제공합니다. 이 기술은 고처리량 세포 기반 스크리닝을 위해 설계되었으며, GPCR 연구의 효율성과 정확성을 약속합니다.
변형되지 않은(Unmodified) GPCR이 왜 그렇게 중요한가요?
GPCR을 타겟으로 하는 약물 개발이라는 고도로 전문화된 분야에서, 변형되지 않은 GPCR을 가지고 연구하는 것의 중요성은 아무리 강조해도 지나치지 않습니다. 기존의 베타-어레스틴 분석법은 GPCR 태깅(tagging, 표지 부착)을 필수적으로 요구하는데, 이러한 과정은 수용체의 유해한 형태 변화를 유발하거나 입체적인 방해(steric hindrance)를 일으키거나 심지어 수용체의 약리학적 특성을 변경할 수 있음이 밝혀졌습니다. 이러한 변형은 생성된 데이터의 생리학적 연관성을 저해할 뿐만 아니라, 우수한 약물 후보 물질을 식별하고 최적화하는 데 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.
이러한 어려움을 인지하고, 발전된 MULTISCREEN™ 기술은 신뢰할 수 있고 정확한 해결책으로 돋보입니다. 다음은 이 기술이 GPCR 연구의 미래를 만들어가는 주요 방식들입니다 :
진정한 약리학적 특성 : GPCR을 본래의 형태 그대로 평가할 수 있게 함으로써, 수용체 약리학적 특성의 무결성을 보호하고 실제 생리학적 상호작용을 더 가깝게 반영하는 데이터를 얻을 수 있도록 길을 엽니다.
데이터의 연관성 : 이 기술은 세포 내에서 자연적으로 발현되는(endogenously expressed) GPCR의 분석을 가능하게 하여, 생성된 데이터가 생체 내(in-vivo) 조건을 매우 관련성 높게 반영하도록 보장하며, 이를 통해 약물 개발 과정에서 예비 스크리닝의 정확성을 높입니다.
타겟 풀 확장 : MULTISCREEN™ 센서 기술은 미발견(orphan) GPCR의 특성 규명을 용이하게 하여 잠재적 타겟의 범위를 넓히고 GPCR 연구 및 약물 개발 기회를 발전시킵니다.
약물 개발 가속화 : 아마도 가장 주목할 만한 특징 중 하나는 여러 GPCR 분석을 수행하기 위해 단일 세포주와 호환된다는 점입니다. 이는 운영 워크플로우를 간소화할 뿐만 아니라 약물 개발 속도를 현저하게 가속화하여 시간과 자원을 절약하면서도 높은 수준의 신뢰성과 효율성을 유지합니다.
변형되지 않은 GPCR을 최우선으로 함으로써, MULTISCREEN™ 센서 기술은 연구자의 무기고에서 강력한 도구로 자리매김하며, 향상된 효능과 GPCR 신호 전달 경로에 숨겨진 잠재력의 진정한 실현을 통해 GPCR 타겟 약물 개발에 혁명을 약속합니다.
MULTISCREEN™ 분석 솔루션
센서 기술은 고객의 특정 분석 요구사항을 충족하기 위해 시약, 키트, 서비스 포트폴리오로 제공됩니다.
MULTISCREEN™ 시약 옵션
- MULTISCREEN™ 베타-어레스틴 센서 유전자를 포함하는 HSV 및 BacMam 바이러스 입자
- 베타-어레스틴 센서 플라스미드
- MULTISCREEN™ 분석 키트 (카탈로그 MSBAK01)
- MULTISCREEN™ BacMam 또는 HSV 분석 키트 (카탈로그 MSBAKBM01-1, MSBAKHSV01-1)
세포주
- MULTISCREEN™ 센서를 안정적으로 발현하는 HEK293 및 CHO 모세포주 (parental cell lines)
- 베타-어레스틴 센서를 공동 발현하는 20개 이상의 GPCR 안정 세포주
- 1000개 이상의 GPCR 발현 세포주
서비스
- 베타-어레스틴 센서와 GPCR을 공동 발현하는 맞춤형 안정 세포주 생성
- MULTISCREEN™ HTS 분석법 개발
- 베타-어레스틴 분석법을 사용한 GPCR 스크리닝 및 프로파일링 서비스
Multispan GPCR Cells, Membranes & Assay Kits
GPCR 항체 프로파일링 서비스 | GPCR Antibody Profiling Services
문의 : 고마바이오텍(주) (02-579-8787)