Cortical neuron과 Inhibitory neuron의 co-culture 방법

1. 필요한 제품 

Product code­­	Description
ax0015, ax0016, ax0018, ax0111, ax0112, ax0113, ax0114, ax0211, ax0411	Human iPSC-derived Cortical Neural Stem Cells (NSCs)
ax0662, ax0667	Human iPSC-derived Cortical Inhibitory Interneuron Progenitors
ax0031	Neural Maintenance Medium
ax0033	Neural Plating Media
ax0674	NeurOne Cortical Neuron Supplement
ax139800 (10 mg)	Recombinant BDNF
ax0053	SureBond-XF
ThermoFisher Scientific	B-27 Supplement
ThermoFisher Scientific	Neurobasal™-A Media
ThermoFisher Scientific	GlutaMAX™
ThermoFisher Scientific	2-Mercaptoethanol (50 mM)
Merck-Sigma	Dibutyryl-cAMP
Merck-Sigma	Ascorbic Acid
Focus Biomolecules	Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor)
Sigma-Aldrich	Poly-D-Lysine (PDL)

 

2. Media 준비

1) Neural Plating Media (#ax0033) 

• Neural Plating Media (#ax0033)에 Y-27632를 혼합하여 final 농도 10uM이 되도록 사용전에 제조합니다. 
• 재냉동해서는 안되고 바로 이용해야 합니다.

2) Neural Maintenance Media (#ax0031) 

• Neural Maintenance Medium (#ax0031)을 사용량에 따라 분주하고 -80도 이하의 온도에서 보관합니다. 
• 사용전에 꺼내어 4도에서 overnight 해동합니다.
• 해동된 media는 4도에서 2주간 보관하였다가 사용할 수 있습니다.

3) Neural Maturation Media 

• Neurobasal™- A Media 500 mL, B-27 supplement 10 mL, GlutaMAX™ 5 mL, 2-Mercaptoethanol (50 mM) 500 µL을 혼합하여 만듭니다.
• 멸균상태의 Class II Biosafety Cabinet에서 핸들링 되어야 합니다.
• Media는 4도에 보관하며 3주 이내에 사용해야 합니다. 

4) Stock solution  

• 아래의 시약을 혼합하여 stock solution을 만듭니다.
• 멸균상태의 Class II Biosafety Cabinet에서 핸들링 되어야 합니다.

Stock concentration	Reconstitution
Y-27632	10 mM (1000x)
BDNF	20 µg/mL (1000x)
cAMP	50 mM (100x)
Ascorbic Acid	20 mM (100x)
PDL	0.5 mg / mL (1x)

5) NeurOne Supplement A (#ax0674a)

• 사용량에 따라 미리 분주합니다. 
• 1ml의 NeurOne Supplement A (#ax0674a)를 50ml의 Neural Maintenance Medium (#ax0031)에 혼합하여 Neural Differentiation Medium을 제조합니다. 
• 총 3번의 full medium change가 필요합니다. 
• 멸균상태의 Class II Biosafety Cabinet에서 핸들링 되어야 합니다.

6) NeurOne Supplement B (#ax0674b)

• 사용량에 따라 미리 분주합니다. 
• 1ml의 NeurOne Supplement B (#ax0674b)를 50ml의 Neurobasal-A Media에 혼합하여 Neural Maturation Medium을 제조합니다. 
• 총 4번의 full medium change가 필요합니다. 
• 멸균상태의 Class II Biosafety Cabinet에서 핸들링 되어야 합니다.

3. Cell culture 용기 코팅

PEI, Polyornithine, Poly-D-lysine, Laminin, Matrigel과 같은 다양한 ECM (extra cellular matrix)가 사용됩니다. 

Axol의 Cortical Excitatory Neuron Progenitors와 Cortical Inhibitory Interneuron Progenitors의 co-culture를 위해서는 다음의 ECM combination을 추천합니다.

1) PDL (poly-D-lysine)

10ml sterile tissue grade water를 5mg PDL에 넣고 24시간동안 RT에 둡니다.

배양용기에 1x PDL solution (0.5mg/ml)을 300ul/cm2 넣고 37도에서 60분간 인큐베이션 한 후 용액을 aspiration하여 버리고 멸균수로 수차례 린스합니다.

물기를 없애고 적어도 2시간 동안 말린 뒤 SureBond-XF로 코팅합니다.

2) SureBond-XF

200x SureBond-XF를 D-PBS(칼슘, 마그네슘 없는)에 희석하여 1x working solution을 만듭니다. (예를 들면, 6ml D-PBS에 30ul SureBond-XF 혼합)

세포배양 용기를 200ul/cm2의 SureBond-XF 1x working solution으로 코팅합니다. 

37도에서 적어도 4시간 이상 인큐베이션 합니다.

SureBond-XF를 제거한 후 cell을 plating 합니다. (SureBond-XF로 코팅한 후에 배양 용기를 wash하지 않습니다. SureBond-XF 코팅이 마르지 않도록 주의합니다.)

4. 세포 배양

1) Interneuron 해동 및 부착 (Day 0)

1. 10uM의 Y-27632을 Neural Plating Media에 혼합합니다.
2. Complete Neural Plating Media를 37도에서 pre-warming 합니다.
3. Neuron이 담긴 cell vial을 질소탱크에서 꺼내어 dry ice에 묻어 해동시킵니다.
4. vial을 dry ice에서 꺼내어 37도 water bath로 즉시 옮깁니다. vial이 완전히 잠기지 않도록 (2/3까지만 잠기도록) 주의합니다. 마지막 얼음조각이 녹은후 vial을 꺼냅니다. 
5. 해동되는 동안 vial을 흔들지 않습니다.
6. vial을 70% 에탄올로 스프레이하고, 멸균종이로 잘 닦은 후 cell culture hood에 놓습니다.
7. 일단 완전히 녹으면 P1000 파이펫을 사용하여 cell을 15ml 멸균 conical tube로 옮깁니다.
8. 각 cryovial을 1ml의 warm Complete Neural Plating Media로 wash하고 conical tube에 담습니다.
9. conical tube에 8ml의 Complete Neural Plating Media를 넣고 10ml serological pipette을 이용하여 세포와 조심스럽게 잘 섞습니다. 이때 세포를 너무 세게 섞지 않도록 주의합니다. 
10. Cell을 실온에서 5분간 200xg로 원심분리합니다.
11. media를 걷어내고 cell pellet에 2ml의 Complete Neural Plating Media를 넣어 single cell suspension이 될때까지 잘 섞습니다.
12. Cell count를 진행합니다. mono-culture일 경우 Interneuron이 100,000-200,000cells/cm2가 되도록 seeding 합니다.
13. Co-culture의 경우에는 Cortical Excitatory Neuron:Interneuron의 비가 3:1-9:1이 될것을 추천합니다.
14. 배양기에서 SureBond-XF coating solution을 제거하고 적당한 양의 Complete Neural Plating Media를 넣습니다. coating이 마르지 않도록 주의합니다.
15. resuspended cell을 plate에 넣습니다.
16. 배양기를 앞뒤로 잘 섞어 세포가 균일하게 퍼지도록 합니다.
17. 세포를 37도, 5% CO2 조건에서 인큐베이션 합니다.

2) Neural Stem Cells 분화 (Day 1-6)

1. 1x NeurOne Supplement A를 Neural Maintenance Media에 넣어 Neural Differentiation Media를 만듭니다.
2. Neural Differentiation Media를 37도에서 pre-warming 합니다.
3. Plating media를 Neural Differentiation Media로 바꿉니다.
4. Day 3, 5일째에 media를 변경해 줍니다.

3) Young Neuron의 Maturation (Day 7-14)

1. 7일째에 1x NeurOne Supplement B, 20ng/ml의 BDNF, 0.5nM cAMP, 0.2mM ascorbic acid를 Neurobasal-A Media에 넣어 Neural Maturation Media를 만듭니다.
2. Neural Maturation Media를 37도에서 pre-warming 합니다.
3. Neural Differentiation Media를 Neural Maturation Media로 바꿉니다.
4. Day 7, 9, 11, 13일째에 media를 변경해 줍니다.

4) Cerebral Cortical Excitatory Neuron과 Inhibitory Neuron의 Long term culture (after day 14)

1. 15일째에 20ng/ml BDNF, 0.5mM cAMP, 0.2mM ascorbic acid를 Neurobasal-A Media에 넣어 Long-Term Culture Media를 만듭니다.
2. 37도에서 pre-warming 합니다.
3. Maturation media를 pre-warmed Long-Term Culture Media로 바꿉니다.
4. Day 15일부터 이틀에 한번씩 교체해 줍니다. 
5. Neuron은 Day 20일 후에 assay에 사용할 수 있습니다. 

* Protocol 원본 보기

* 관련 제품

• Cortical excitatory neuron
• Inhibitory Interneuron

문의 : 고마바이오텍(주) (02-579-8787)