Cerebral Cortical Neurons, Interneuron, Astrocytes의 tri-culture 방법
1. 필요한 제품
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Product code |
Description |
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ax0015, ax0016,
ax0018, ax0111, ax0112, ax0113, ax0114, ax0211, ax0411 |
Human
iPSC-derived Cortical Neural Stem Cells (NSCs) |
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ax0662, ax0667 |
Human
iPSC-derived Cortical Inhibitory Interneuron Progenitors |
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ax0665 |
Human
iPSC-derived Astrocytes |
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ax0031 |
Neural
Maintenance Medium |
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ax0033 |
Neural Plating
Media |
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ax0674 |
NeurOne Cortical
Neuron Supplement |
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ax139800 (10 mg) |
Recombinant BDNF |
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ax0053 |
SureBond-XF |
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ThermoFisher
Scientific |
B-27 Supplement |
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ThermoFisher
Scientific |
Neurobasal™-A
Media |
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ThermoFisher
Scientific |
GlutaMAX™ |
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ThermoFisher
Scientific |
2-Mercaptoethanol
(50 mM) |
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Merck-Sigma |
Dibutyryl-cAMP |
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Merck-Sigma |
Ascorbic Acid |
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Focus
Biomolecules |
Y-27632 2HCl
(ROCK inhibitor) |
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Sigma-Aldrich |
Poly-D-Lysine
(PDL) |
2. Media 준비
1) Neural Plating Media (#ax0033)
- Neural Plating Media (#ax0033)에 Y-27632를 혼합하여 final 농도 10uM이 되도록 사용전에 제조합니다.
- 재냉동해서는 안되고 바로 이용해야 합니다.
2) Neural Maintenance Media (#ax0031)
- Neural Maintenance Medium (#ax0031)을 사용량에 따라 분주하고 -80도 이하의 온도에서 보관합니다.
- 사용전에 꺼내어 4도에서 overnight 해동합니다.
- 해동된 media는 4도에서 2주간 보관하였다가 사용할 수 있습니다.
3) Neural Maturation Media
- 아래의 시약을 혼합하여 Neutral Maturation Media를 만듭니다.
- 멸균상태의 Class II Biosafety Cabinet에서 핸들링 되어야 합니다.
- Media는 4도에 보관하며 3주 이내에 사용해야 합니다.
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Components |
Volume |
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Neurobasal™- A Media |
500 mL |
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B-27 supplement |
10 mL |
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GlutaMAX™ |
5 mL |
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2-Mercaptoethanol (50 mM) |
500 µL |
4) Stock solution
- 아래의 시약을 혼합하여 stock solution을 만듭니다.
- 멸균상태의 Class II Biosafety Cabinet에서 핸들링 되어야 합니다.
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Components |
Stock concentration |
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Y-27632 |
10 mM (1000x) |
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BDNF |
20 µg/mL (1000x) |
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cAMP |
50 mM (100x) |
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Ascorbic Acid |
20 mM (100x) |
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PDL |
0.5 mg / mL (1x) |
5) NeurOne Supplement A (#ax0674a)
- 사용량에 따라 미리 분주합니다.
- 1ml의 NeurOne Supplement A (#ax0674a)를 50ml의 Neural Maintenance Medium (#ax0031)에 혼합하여 Neural Differentiation Medium을 제조합니다.
- 총 3번의 full medium change가 필요합니다.
- 멸균상태의 Class II Biosafety Cabinet에서 핸들링 되어야 합니다.
6) NeurOne Supplement B (#ax0674b)
- 사용량에 따라 미리 분주합니다.
- 1ml의 NeurOne Supplement B (#ax0674b)를 50ml의 Neurobasal-A Media에 혼합하여 Neural Maturation Medium을 제조합니다.
- 총 4번의 full medium change가 필요합니다.
- 멸균상태의 Class II Biosafety Cabinet에서 핸들링 되어야 합니다.
3. Cell culture 용기 코팅
PEI, Polyornithine, Poly-D-lysine, Laminin, Matrigel과 같은 다양한 ECM (extra cellular matrix)가 사용됩니다.
Axol의 Cortical Excitatory Neuron Progenitors와 Cortical Inhibitory Interneuron Progenitors의 co-culture를 위해서는 다음의 ECM combination을 추천합니다.
1) PDL (poly-D-lysine)
10ml sterile tissue grade water를 5mg PDL에 넣고 24시간동안 RT에 둡니다.
배양용기에 1x PDL solution (0.5mg/ml)을 300ul/cm2 넣고 37도에서 60분간 인큐베이션 한 후 용액을 aspiration하여 버리고 멸균수로 수차례 린스합니다.
물기를 없애고 적어도 2시간 동안 말린 뒤 SureBond-XF로 코팅합니다.
2) SureBond-XF
200x SureBond-XF를 D-PBS(칼슘, 마그네슘 없는)에 희석하여 1x working solution을 만듭니다. (예를 들면, 6ml D-PBS에 30ul SureBond-XF 혼합)
세포배양 용기를 200ul/cm2의 SureBond-XF 1x working solution으로 코팅합니다.
37도에서 적어도 4시간 이상 인큐베이션 합니다.
SureBond-XF를 제거한 후 cell을 plating 합니다. (SureBond-XF로 코팅한 후에 배양 용기를 wash하지 않습니다. SureBond-XF 코팅이 마르지 않도록 주의합니다.)
4. 세포 배양
1) Interneuron 해동 및 부착 (Day 0)
- 10uM의 Y-27632을 Neural Plating Media에 혼합합니다.
- Complete Neural Plating Media를 37도에서 pre-warming 합니다.
- Neuron이 담긴 cell vial을 질소탱크에서 꺼내어 dry ice에 묻어 해동시킵니다.
- vial을 dry ice에서 꺼내어 37도 water bath로 즉시 옮깁니다. vial이 완전히 잠기지 않도록 (2/3까지만 잠기도록) 주의합니다. 마지막 얼음조각이 녹은후 vial을 꺼냅니다.
- 해동되는 동안 vial을 흔들지 않습니다.
- vial을 70% 에탄올로 스프레이하고, 멸균종이로 잘 닦은 후 cell culture hood에 놓습니다.
- 일단 완전히 녹으면 P1000 파이펫을 사용하여 cell을 15ml 멸균 conical tube로 옮깁니다.
- 각 cryovial을 1ml의 warm Complete Neural Plating Media로 wash하고 conical tube에 담습니다.
- conical tube에 8ml의 Complete Neural Plating Media를 넣고 10ml serological pipette을 이용하여 세포와 조심스럽게 잘 섞습니다. 이때 세포를 너무 세게 섞지 않도록 주의합니다.
- Cell을 실온에서 5분간 200xg로 원심분리합니다.
- media를 걷어내고 cell pellet에 2ml의 Complete Neural Plating Media를 넣어 single cell suspension이 될때까지 잘 섞습니다.
- Cell count를 진행합니다. mono-culture일 경우 Interneuron이 100,000-200,000cells/cm2가 되도록 seeding 합니다.
- Co-culture의 경우에는 Cortical Excitatory Neuron:Interneuron의 비가 3:1-9:1이 될것을 추천합니다.
- 배양기에서 SureBond-XF coating solution을 제거하고 적당한 양의 Complete Neural Plating Media를 넣습니다. coating이 마르지 않도록 주의합니다.
- resuspended cell을 plate에 넣습니다.
- 배양기를 앞뒤로 잘 섞어 세포가 균일하게 퍼지도록 합니다.
- 세포를 37도, 5% CO2 조건에서 인큐베이션 합니다.
2) Neural Stem Cells 분화 (Day 1-6)
- 1x NeurOne Supplement A를 Neural Maintenance Media에 넣어 Neural Differentiation Media를 만듭니다.
- Neural Differentiation Media를 37도에서 pre-warming 합니다.
- Plating media를 Neural Differentiation Media로 바꿉니다.
- Day 3, 5일째에 media를 변경해 줍니다.
3) Young Neuron의 Maturation (Day 7-18)
- 7일째에 1x NeurOne Supplement B, 20ng/ml의 BDNF, 0.5nM cAMP, 0.2mM ascorbic acid를 Neurobasal-A Media에 넣어 Neural Maturation Media를 만듭니다.
- Neural Maturation Media를 37도에서 pre-warming 합니다.
- Neural Differentiation Media를 Neural Maturation Media로 바꿉니다.
- Day 7, 9, 11, 13, 15일째에 media를 변경해 줍니다.
4) Astrocyte 해동 및 부착 (Day 19)
- 10ng/ml Heregulin을 Neural Maintenance Media에 넣어 Co-culture media를 만듭니다.
- Co-culture media를 37도에서 pre-warming 합니다.
- Astrocyte cell vial을 질소탱크에서 꺼내어 dryice에 묻습니다.
- vial을 dry ice에서 꺼내어 37도 water bath로 즉시 옮깁니다. vial이 완전히 잠기지 않도록 (2/3까지만 잠기도록) 주의합니다. 마지막 얼음조각이 녹은후 vial을 꺼냅니다.
- 해동되는 동안 vial을 흔들지 않습니다.
- vial을 70% 에탄올로 스프레이하고, 멸균종이로 잘 닦은 후 cell culture hood에 놓습니다.
- 일단 완전히 녹으면 P1000 파이펫을 사용하여 cell을 15ml 멸균 conical tube로 옮깁니다.
- Cryovial에 1ml의 따뜻한 Co-Culture Media에 넣고 wash하여 15ml 멸균 conical tube에 옮깁니다.
- 8ml의 Co-Culture Media를 conical tube의 cell suspension에 넣고 10ml serological pipette으로 cell과 media를 잘 섞습니다. 이때 너무 세게 섞거나 파이펫팅시 버블이 생기지 않도록 주의합니다.
- 실온에서 5분간 200 x g에서 원심분리합니다.
- media를 조심스럽게 흡인하고, cell pellet을 2ml Co-Culture Media에 resuspending하여 single cell suspension을 만듭니다.
- 세포 수를 측정합니다. Astrocyte는 original excitatory neuron/NSC seeding density의 1:9 비율로 추가합니다. (대체적으로 20,000-30,000 cells/cm2를 이용합니다.)
- Resuspended cell을 골고루 plating 합니다.
- Cell을 37°C, 5% CO2 조건에서 인큐베이션 합니다.
5) Cerebral cortical excitatory neurons, inhibitory interneurons, astrocytes의 tri-culture (Day 19-25)
- 21일째에 Co-Culture Media를 37도에서 pre-warming 합니다.
- 사용된 Co-Culture Media 반을 fresh pre-warmed Co-Culture Media로 교체합니다.
- Day 23과 25에 이러한 media 교체를 진행합니다.
- Assay는 Day 26일째에 진행할 수 있습니다. 자발적인 전기활성 신호는 약 Day 21쯤에 나타나고 Synchronised Burst Firing은 약 Day 30일 쯤에 잘 나타납니다.
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문의 : 고마바이오텍(주) (02-579-8787)