RNA work시 고려할 점
DNA 작업에 비해 RNA 작업은 어렵고 신경 써야 할 부분이 많습니다. DNA는 매우 안정적이고 단단한 반면, RNA의 화학 구조는 가수분해되기 쉬운 경향이 있어 안정성이 훨씬 떨어집니다. DNA와 RNA는 모두 nuclease에 의해 분해될 수 있지만 RNase 효소는 매우 안정적이고 변성 후 쉽게 다시 접히므로 영구적으로 비활성화기 어렵습니다. RNase는 신체의 바이러스 방어 시스템의 일부로 피부, 모발 및 타액으로 분비되어 실험 샘플을 쉽게 오염시키고 연구자에게 문제를 일으킬 수 있습니다. DNA를 정량화하고 시각화하기 위한 형광 기반 시약이 많은 반면 RNA 정량 시약은 낮은 민감도와 특이성으로 인해 그리 많지 않습니다.
이 tech tip에서는 RNA 샘플을 쉽게 분리하고 분석하는 데 도움이 되는 툴을 소개합니다.
1. RNA 다루기
RNA가 오염되지 않게 하기 위해서는 우선 개인보호장비 (PPE, personal protective equipment)를 잘 갖추는 것로부터 시작합니다. RNA 작업시, 장갑으로 무엇을 만지고 있는지 항상 인식하고 있어야 합니다. RNase가 피부에서 장갑으로 옮겨갈 수 있으므로 얼굴이나 머리카락을 만지지 말아야 하고 깨끗하지 않은 장비나 표면을 만진 경우 장갑을 교체해야 합니다. 특히 pure RNA 샘플을 핸들링하기 전에는 항상 새 장갑을 끼는 것이 좋습니다.
RNA 작업을 시작하기 전에 벤치탑, 피펫 및 사용할 기타 장비를 포함하여 작업 공간의 오염을 제거하는 것이 좋습니다. 이러한 표면에 RNase-X™ 오염 제거 용액을 분사하고 닦은 다음 dH2O 또는 70% 에탄올을 분사하고 다시 닦는 방식으로 표면을 청소합니다.
RNA 작업에 사용할 튜브, 팁, 물, 버퍼 및 시약은 RNase가 없어야 합니다. 인증된 RNase-free 제품(예: Water, Ultrapure Molecular Biology Grade)은 시중에서 쉽게 구할 수 있습니다. 높은 등급의 고품질 재료와 초순수로 만든 homemade 시약은 RNaseAlert®와 같은 RNase 테스트 분석을 사용하여 RNase-free 여부를 검증할 수 있습니다. 또 다른 일반적인 방법은 용액을 DEPC(디에틸 피로카보네이트)로 처리하여 RNase를 비활성화하는 것입니다. 그러나 DEPC 처리에는 몇 가지 단점이 있습니다. Tris 함유 또는 기타 아미노 함유 용액과 함께 사용할 수 없으며, autoclave가 필요하고, RNase를 완전히 비활성화 시키지 못할 수 있으며, 용액을 약산성화 시키고 DEPC 부산물은 다운스트림 프로세스를 억제합니다. 따라서 DEPC 대신 RNase-free로 검증된 솔루션을 사용하는 것이 좋습니다.
RNase에 의한 효소적 분해와는 별개로, RNA는 phosphodiester backbone의 파손을 유발하는 가수분해에 민감합니다. EDTA는 Mg2+와 같은 2가 양이온이 가수분해를 증가시키기 때문에 보호 효과가 있습니다. RNA는 알칼리성 용액에서 더 심하게 가수분해 되므로 RNA는 pH 7.5보다 높은 용액에 보관하면 안 됩니다. 구연산염 버퍼 pH 6 또는 TE 버퍼 pH 7.5에 저장할 경우 RNA가 안정하게 보관됩니다. 온도는 보관 중 RNA 안정성에서 가장 중요한 요소입니다. 최상의 안정성과 장기 보관을 위해 RNA는 -70°C에서 보관해야 합니다. 단기 보관의 경우 RNA는 4°C 또는 -20°C에서 최소 3주 동안 안정적입니다.
2. RNA 분리
배양 세포 및 신선한 조직의 경우 total cellular RNA는 여러 가지 방법으로 분리할 수 있습니다. 핵산을 추출하는 원래 방법은 페놀과 클로로포름을 사용하여 단백질과 지질을 organic phase로, 핵산을 aqueous phase로 분리합니다. 이 과정은 산성 조건에서 수행되어 RNA를 선택적으로 추출할 수 있습니다. 관련하여 TRI Reagent™(TRIzol™이라고도 함)를 이용하는 방법이 있는데, 이는 페놀 및 클로로포름과 함께 guanidinium 염을 사용합니다.
오늘날 많은 연구자들은 위험한 화학 물질과 까다로운 phase 분리 기술을 써야하는 페놀 기반 방법의 사용을 피하고, 컬럼 기반 RNA 분리 키트를 사용하는 것을 선호합니다. 더 간단한 정제 솔루션을 찾는 사람들을 위해 CELLDATA RNAstorm™ Fresh Cell 및 Tissue RNA Isolation Kit와 같은 사용하기 쉬운 키트가 있습니다. 이러한 많은 키트는 RNA를 선택적으로 분리하기 위해 guanidinium 염 및 실리카 멤브레인 컬럼을 사용하고, 또 어떤 키트들은 magnetic bead를 이용하기도 합니다.
이러한 여러 방법들을 통해 분리된 총 RNA의 95% 정도는 리보솜 RNA로 구성됩니다. total RNA로부터 mRNA를 정제하는 것이 바람직한 경우도 있으나 mRNA는 세포 RNA 중 차지하는 비율이 적기 때문에 높은 수율의 mRNA를 얻고 리보솜 RNA를 모두 제거하는 것이 어려울 수 있습니다. mRNA의 poly A 꼬리에 결합하는 oligo dT로 코팅된 비드를 사용하여 샘플에서 mRNA를 농축하는 방법은 일반적으로 많이 이용됩니다.
NGS (차세대 시퀀싱) 방법의 출현으로 말미암아 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직으로부터의 RNA 분리에 대한 필요성이 높아지고 있습니다. 환자들의 샘플이 대부분 이런방식으로 보존되고 있기 때문입니다. 포름알데히드가 RNA를 단백질에 화학적으로 crosslink 시키기 때문에 FFPE 조직에서 고품질 RNA를 정제하는 것은 신선한 세포에서 분리하는 것 보다 더 어렵습니다. 고열 처리로 인해 조각이 단편화되거나 품질이 낮은 RNA를 초래할 수 있습니다.
CELLDATA RNAstorm™ FFPE RNA 추출 키트는 독점 기술을 사용하여 포름알데히드 가교 결합을 효소적으로 역전시켜 고온 및 위험한 용매의 사용을 피합니다. 이는 RIN 점수 또는 DV200으로 측정할 때 다른 FFPE 분리 키트에 비해 단편화가 적고 증폭성이 큰 RNA를 생성합니다.
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3. RNA 검출
핵산을 정량화하는 고전적인 방법은 260nm(A260)에서 UV 흡광도를 측정하는 것입니다. A260 nm는 RNA와 DNA를 구별하지 못하지만 RNA가 매우 pure하다고 확신하는 경우(즉, 샘플에 free 뉴클레오티드 또는 DNA가 없음) RNA를 정량화하는 데 유용한 방법이 될 수 있습니다. RNA의 경우 A260 nm에 40을 곱하면 농도가 ng/uL로 표시됩니다. 280nm에서 강하게 흡수하는 단백질과 같은 오염 물질을 찾기 위해 280nm에서 흡광도를 측정합니다.
260/280 비율이 2.0이나 그 이상이면 일반적으로 순수한 RNA로 간주됩니다. 그러나 260/280 비율은 pH에 따라 달라질 수 있습니다. 가능한 한 항상 동일한 용매를 사용하여 실험 간에 흡광도 판독값을 일관되게 유지하는 것이 좋습니다.
형광 dye를 이용 RNA 정량 분석은 A260 측정보다 감도와 선형성이 훨씬 크기 때문에 RNA를 가장 정확하게 정량하는 방법입니다. 또한 일부(전부는 아님) 어세이는 dsDNA보다 ssRNA에 대해 선택적이라는 이점이 있으므로 오염된 DNA가 있는 경우에도 정확한 RNA 농도를 얻을 수 있습니다. AccuBlue® Broad Range RNA Quantitation Kit는 dsDNA보다 RNA에 대한 선택성이 매우 높으며 광범위한 RNA 농도에서 정확합니다. RiboGreen®과 같은 일부 다른 회사의 형광 RNA 검출 염료는 민감하지만 RNA 특이적이지 않으며 샘플에 있는 dsDNA도 검출합니다.
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RNA의 무결성 또는 크기를 확인하기 위해 겔 전기영동을 수행할 수 있습니다. RNA 전기영동은 2차 구조가 겔을 통한 이동에 영향을 미치지 않도록 RNA를 변성시키기 위해 항상 독성이 있는 복잡한 포름알데히드 겔이 필요하다고 생각될 수 있지만, 목적이 RNA를 시각적으로 평가하는 것이라면 로딩 버퍼에 denaturing agent가 포함되어 있는 한 일반 아가로스 젤을 사용할 수 있습니다. EMBER500™ RNA Prestain Loading Dye를 RNA 샘플에 추가하면 한 단계로 RNA를 변성, 로딩 및 염색할 수 있습니다. EMBER500™ 염료는 ethidium bromide보다 훨씬 더 민감하므로 25ng의 total RNA를 검출할 수 있으며 소중한 샘플을 보존할 수 있습니다. miRNA 또는 최대 200개 뉴클레오티드 길이의 다른 RNA를 관찰하는 경우 폴리아크릴아미드(PAGE) 젤을 사용하여 RNA 젤 전기영동을 수행할 수도 있습니다.
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문의 : 고마바이오텍(주) (02-579-8787)