Tech Tip: Exosome Isolation and Staining Protocols
PEG 침전 또는 size exclusion chromatography(SEC)를 사용하여 세포 상층액에서 엑소좀을 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. dye 및 항체를 사용한 유세포 분석 방법도 함께 안내합니다.
- Cell Plating and Conditioned Medium Collection
- 30% PEG Isolation Method (Enriched Exosomes)
- qEV SEC Isolation Method (qEV Exosomes)
- Staining Enriched or Purified Exosomes with Dyes
- Staining Enriched or Purified Exosomes with Antibodies
- Analyzing Enriched or Purified Exosomes By Flow Cytometry
- Isolating and Staining Bead-Bound Exosomes
1. Cell Plating and Conditioned Medium Collection
세포를 풀고 conditioned medium을 제작하는 방법입니다.
(세포마다 배양조건은 다를 수 있으며, 여기에 작성된 조건은 가이드라인으로 참고하시기 바랍니다.)
필요한 물품
- Complete growth medium
- Serum-free growth medium
- Sterile 0.2 um cellulose acetate (CA) syringe filter
방법
1. adherent cell은 T75 flask에 20ml의 complete cell culture media를 이용하여 cell이 충분한 confluency가 될때까지 배양한다. suspension cell은 최소 20ml의 complete cell culture media로 cell이 high density에 이를때까지 배양한다. (예, Jurkat cell의 경우 2x10^6 cells/ml)2. exosome을 분리하기 이틀전에 media를 serum-free media로 교체한다. suspension cell의 경우, cell을 pelleting한 후 serum-free media로 resuspending 한다.
6. exosome 분리를 실행하고, 이 conditioned medium을 4도에서 보관한다.
2. 30% PEG Isolation Method (Enriched Exosomes)
PEG를 이용하여 Exosome을 농축하는 방법입니다.
필요한 물품
- Polyethylene Glycol (PEG) 6,000. Prepare a 30% solution in dH2O or sterile-filtered PBS.
- Sterile-filtered PBS + 0.1% BSA
방법
Day 1
1. fresh 혹은 보관한 conditioned medium을 꺼낸다.
2. conditioned medium의 0.5 volume에 해당하는 30% PEG 6000를 넣는다. (예, 20ml의 conditioned medium에 30% PEG 10ml 추가)
3. 용액이 균질해 지도록 tube를 흔들어 잘 섞는다.
4. mixture를 4도에서 밤새 인큐베이션한다 (rocking 필요없음)
Day 2
5. mixture를 4도에서 1시간동안 10,000g로 원심분리한다.
6. 상층액을 조심스럽게 따라내고, tube를 거꾸로 하여 남은 용액마저 다 제거한다.
7. pellet을 filtered 0.1% BSA in 1X PBS로 resuspend 한다.
8. 농축된 exosome을 tube당 500ul씩 분주하고 -80도에 보관하거나 바로 사용한다.
3. qEV SEC Isolation Method (qEV Exosomes)
EV SEC column을 이용하여 exosome을 분리하는 방법입니다.
필요한 물품
- Vivaspin® 20, 10 kD columns (Vivaproducts Cat. No. VS2002)
- qEVoriginal 70 nm columns (IZON Cat. No. SP1)
- Sterile-filtered PBS
방법
Day 1
1. qEV column을 실온에서 준비한다.
2. conditioned medium을 가져온다.
3. conditiond medium을 Vivaspin tube를 이용하여 20ml에서 500ul로 농축한다. (3700g에서 10분간 spin하고, 필요시 500ul가 될때까지 반복한다.)
4. qEV column을 rack에 꽂고 buffer와 sample이 중력에 의해 column을 통과한 flow through를 collection 한다.
5. 10ml의 PBS를 column에 넣고 waste tube로 씻어내며, 이 flow-through는 버린다.
6. 0.5ml의 concentrated conditioned medium을 column의 loading frit에 넣는다.
7. 샘플이 column에 로딩되면 loading frit을 약 4ml의 PBS로 채우고 collecting을 시작한다.
8. 처음 3ml은 waste이므로 waste tube에 수집한다.
9. waste tube를 clean collection tube로 바꾸고 수집을 시작한다. 처음 3ml 이후에 얻는 2ml은 exosome sample이 된다.
10. 일단 2ml exosome sample을 얻은 후에는 다시 waste tube를 column 밑에 두고 15ml의 PBS로 column을 flush 한다. column은 필요시 재 사용을 위해 4도에 보관해 둔다.
11. exosome sample을 tube당 500ul씩 분주하여 -80도에 보관해 둔다.
4. Staining Enriched or Purified Exosomes with Dyes
농축되거나 정제된 엑소좀을 dye로 염색하는 방법입니다.
엑소좀 염색 dye는 Biotium사의 ExoBrite EV Membrane Stain을 이용하였습니다.
필요한 물품
- Sterile-filtered PBS
- ExoBrite™ EV Membrane Stains - Cat. No. 30111-30114 (or other fluorescent dyes)
방법
1. exosome을 해동한다.
2. staining buffer를 준비한다. dye는 최종 농도가 1X가 되도록 희석하여 샘플당 900ul를 만든다.
3. exosome을 flow tube에 100ul씩 분주하고 남은 exosome은 다시 -80도에 보관한다. exosome 없이 dye만 있는 tube를 준비하여 background control로 사용해야 한다.
4. 900ul의 staining buffer를 적당한 tube로 옮기고 vortexing한다.
5. 30분간 어두운 실온에서 incubation한다.
5. Staining Enriched or Purified Exosomes with Antibodies
농축 혹은 정제된 엑소좀을 항체로 염색하는 방법입니다.
엑소좀 항체는 CD9, CD63, CD81 항체를 이용하였습니다.
필요한 물품
- Sterile-filtered PBS
- Primary antibodies (i.e., ExoBrite™ CD9 Flow Antibody, ExoBrite™ CD63 Flow Antibody, or ExoBrite™ CD81 Flow Antibody)
- Isotype control antibodies (i.e., ExoBrite™ IgG1 Isotype Control Flow Antibody)
방법
1. exosome을 해동한다.
2. exosome을 100ul씩 분주하여 flow tube에 넣고 남은 exosome은 다시 -80도에 보관한다.
3. 필요한 양의 labeled antibody를 2번의 각 tube에 넣고 잘 섞는다. 동일한 dye로 라벨링된 isotype control antibody로 염색한 exosome을 함께 준비한다.
[NOTE] ExoBrite Flow Antibody는 5ul를 사용한다. 다른 회사의 항체의 경우 starting 농도는 0.1ug을 제안하지만, 적정농도는 실험자가 자체적으로 결정해아 한다.
ExoBrite™ Isotype Control Flow Antibody는 ExoBrite™ Flow tetraspanin antibodies와 함께 사용될 수 있다.
4. exosome이 없는 항체에 PBS만 넣은 tube를 준비하여 background control로 이용한다.
5. 30분간 어두운 실온에서 incubation 한다.
6. 900ul의 PBS를 넣어 flow에서 샘플을 런닝한다.
6. Analyzing Enriched or Purified Exosomes By Flow Cytometry
농축 및 정제된 엑소좀을 유세포 분석기로 분석하는 방법입니다.
방법
1. flow cytometer의 SSC를 Violet laser로 (V-SSC) configuration 한다.
2. fluorescent sizing bead를 런닝하고, 가장 작은 비드를 V-SSC threshold로 지정한다.
3. 샘플을 2분동안 천천히 흘리고 dye에 맞는 적합한 채널에서 분석한다.
4. exosome을 분석하기 위해서는 x축은 형광 dye channel로, y축은 V-SSC로 plot을 생성한다. 염색된 exosome은 diagonal population으로 나타난다. 이 주변으로 gating을 하고 dye alone이나 antibody alone 부분에 gate를 copy한다. stained exosome gate 내에 존재하는 파티클의 %는 샘플내 exosome의 농도와 상대성을 갖는다. dye alone에서 gate내의 파티클 %는 1% 미만으로 낮아야 exosome과 비슷한 사이즈로 형성된 aggregate와 구분할 수 있다.
7. Isolating and Staining Bead-Bound Exosomes
Bead로 bounding된 엑소좀을 분리 및 염색하는 방법입니다.
필요한 물품
- Magnetic Immunoaffinity Isolation/Detection beads (i.e., beads with tetraspanin antibodies)
- A magnet stand for use with microcentrifuge tubes
- Sterile-filtered PBS
방법
Day 1
1. 농축된 exosome을 해동하거나 신선하게 농축된 exosome을 이용한다. test antibody 혹은 isotype control당 100ul의 exosome이 필요하다.
2. bead를 30초간 vortexing하여 resuspend 시킨다.
3. microfuge tube당 40ul의 bead를 넣는다. 각 tube는 각 test 항체와 isotype control을 담는다.
4. tube를 magnet으로부터 분리하여 300ul의 PBS로 magnetic bead를 씻어내고 pipetting으로 잘 섞는다.
5. tube를 magnet에 놓고 1분간 방치한 뒤, 상층액을 파이펫으로 떠서 버린다.
6. tube를 magnet에서 분리하여 농축된 exosome을 각 tube에 100ul씩 넣는다.
7. tube를 rocker에 놓고 4도에서 밤새 incubation 한다.
Day 2
1. tube를 magnet에 놓고 1분간 방치한뒤 상층액을 파이펫으로 떠서 버린다.
2. tube를 magnet에서 분리하여 bead-bound exosome을 300ul PBS로 wash하고 파이펫팅하여 잘 섞는다.
3. tube를 magnet에 놓고 1분간 방치한뒤 상층액을 버린다.
4. bead-bound exosome을 100ul PBS에 resuspend 한다.
5. 1ug의 1차 항체를 넣는다. isotype control도 함께 넣는다.
[NOTE] Lipophilic dye는 끈끈하여 bead에 붙을 수 있으므로, bead-bound exosome에 사용될 수 없다. ExoBrite EV Membrane stain은 bead-bound exosome 염색에 사용될 수 있다.
6. tube를 rocker에 놓고 4도에서 1시간동안 incubation 한다.
7. tube를 magnet에 놓고 1분간 방치한뒤 상층액을 파이펫으로 떠서 버린다.
8. tube를 magnet에서 분리하여 bead-bound exosome을 300ul PBS로 wash하고 파이펫팅하여 잘 섞는다.
9. tube를 magnet에 놓고 1분간 방치한뒤 상층액을 버린다.
10. bead-bound exosome을 500ul PBS에 resuspend 하고 flow tube로 옮긴다.
11. 샘플을 유세포분석기에서 천천히 흘리면서 샘플별 최소 2000 event를 수집한다.
엑소좀 연구 시약 문의 : 고마바이오텍(주) (02-579-8787)