HepaRG 3D 및 co-culture 적용 모델
HepaRG는 primary human hepatocyte (PHH)와 동등한 기능과 활성을 발현하는 immortalized cell line으로, 신약후보물질의 ADME, Toxicity 분석에 이용됩니다. PHH에서 발현되는 gene의 95% 이상을 동등하게 발현하며, 배치간 재현성이 우수하고, 또한 배양에서 최대 4주까지 생존할 수 있어 장기간 연구와 약물 및 화학 물질에 대한 반복적인 처리와 관찰이 가능합니다.
HepaRG는 다양한 배양 방식을 통해 3D culture, spheroid 제작, Biochip 모델, chimeric animal model 및 co-culture등에 이용될 수 있습니다.
3D culture Bioreactor
Nibourg 연구팀은 HepaRG 세포를 Academic Medical Center 생체 인공 간 (bioartificial liver, AMC-BAL) 제작에 이용하였습니다. DMSO가 없는 상태에서 배양된 HepaRG-AMC-BAL은 암모니아 및 젖산을 제거하고, CYP3A4 수준을 잘 유지하면서 1차 인간세포와 유사한 속도로 apolipoprotein A-1을 생성하였습니다. (Nibourg et al., PLOSone, 2012)
광범위한 cell-cell contact을 갖는 3D 구조는 BAL내 존재하는 matrix fiber와 모세관 주위에 형성됩니다. 배지에 carbamoylglutamate가 있으면 urea-cycle 활성을 증가시키는데, 이는 암모늄과 같은 독성이 강한 내인성 대사산물을 제거하는 기능을 갖는 BAL을 개발할 때 특히 중요합니다. 예를 들어, HepaRG-AMC-BAL은 급성간부전이 있는 쥐의 생존 시간을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 또한 암모니아 축적으로 인한 간성뇌증 및 신부전의 진행은 HepaRG-AMC-BAL 처리에 의해 약화되었습니다.
또한 3D spinner-bioreactor에서 배양된 HepaRG™ 세포는 간과 유사한 성능을 보여주고 독성역학적 접근에 대한 실질적인 적용 가능성을 보여주는 독성 연구를 위한 매력적인 도구입니다.
3D Hepatocyte 형성을 위한 Spheroid Model
Hanging drop 방식은 정확하고 표준화된 크기의 간세포 spheroid를 생산하기 위한 방법입니다. 이 기술을 통해 HepaRG는 3-6일 후에 직경 200um의 2000개 spheroid를 형성하고, 생성된 3D 미세 조직은 담즙소관 (bile canaliculi)의 극성 위치등이 간과 유사하게 형성되어 3주 이상 유지됩니다.
HepaRG spheroid의 albumin 분비는 2D HepaRG cell culture에서보다 높게 지속적으로 유지되었으며, 마찬가지로 urea, glucose, lactate, pyruvate 역시 3D spheroid에서 더 높게 생성되었습니다. 특히 17-21일 정도에서 훨씬 더 높았습니다. 아세트아미노펜의 세포독성은 2D에서보다 3D spheroid에서 더 높았고, 이는 CYP2E1 활성이 3D에서 훨씬 더 높아서 중간 독성 물질인 NAPQI가 더 많이 생산되었음을 말합니다.
대사적으로 안정적인 HepaRG spheroid의 사용은 장기간동안의 toxicity study에 효과적이며, Kupffer cell과 같은 non-parenchymal cell과 함께 배양하면 기존의 2D short-term 1차 간세포에서 검출되지 않은 화합물의 독성을 명확히 설명하는데 도움을 줄 수 있을것입니다.
Structure of HepaRG™ spheroids after 20 days in culture. (A) HE staining; (B) MRP-2 activity, assessed using CMFDA assay (Adapted from Gunness et al., Toxicol. Sci, 2013.)
다른 세포와의 공동 배양을 위한 Biochip microfluidic models
배지가 세포 위로 흐를 수 있도록 하는 co-culture 및 fluidic system을 포함하여 보다 복잡한 in vitro hepatic model이 개발되었습니다.
미세 유체 조건은 생체 내 혈액 흐름과 세포 구조를 재현하여 기능을 향상 시킵니다. 이 모델의 또다른 용도는 장기에 있는 화합물의 독성 여부를 조사하는 것입니다.
신장이나 뇌는 간에서 독성 대사 산물에 대한 생물학적 활성화의 결과를 반영할 수 있으므로, microfluidic biochip에서 MDCK cell과 liver-kidney co-culture를 진행하여 입증해 보았습니다. (Biotechnol Bioeng., 2013)
항암제인 ifosfamide의 신장독성이 CYP3A4/5 및 CYP2B6를 포함하는 간 경로를 통한 acrolein의 생체변형 때문임을 입증하였습니다. MDCK cell만 ifosfamide와 함께 배양했을 때 무독성이었으나 HepaRG cell과 공동배양 했을때는 이들 세포에 현저하게 독성을 나타내었습니다.
Photo of the perfusion system (A) and the details of the liver-Kidney microfluidic bioreactor (B). Taken from Choucha-Snouber et al., 2010. Read full publication
Human liver를 생산하는 Chimeric animals 모델
다른 세포로 분화되는 Stem cell로서의 HepaRG
HepaRG 세포는 생체 내 간 전구 세포의 주요 마커를 발현하는 이분화능 전구 세포입니다.
HepaRG를 저밀도로 플레이팅하면 간세포와 담도 세포로 전환 분화됩니다. 이러한 특성은 어떻게 HepaRG cell이 췌장세포 (pancreatic cell)이나 담관세포 (cholangiocyte)와 같은 다른 세포를 생성하는지 확인하기 위해 조사되어 왔으며, Dianat et. al 은 HepaRG progenitor cell이 성장 호르몬, EGF, IL-6, taurocholate를 사용하여 담관세포로 분화하였음을 입증하였습니다. (Hepatology, 2014) 생성된 담관세포는 adult-specific marker 인 cytokeratin 7, osteopontin, SOX9, HNF-6를 발현하였고 호르몬 자극에 대해 칼슘을 방출하는 등의 기능을 보여주었습니다.
HepaRG cell이 보여주는 이러한 가소성은 다양한 세포 유형을 생성하는 것 뿐 아니라 HepaRG 세포 자체에 대한 광범위한 연구 영역을 열어줍니다.
Co-culture models
Liver-Intestinal co-culture model
공동 배양 모델은 생체 내에서 발생하는 조직 간의 cross-talk을 설명하는데 도움을 줍니다. 예를 들어, Rossi et al. (TIV. 2012)은 Caco-2와 HepaRG™ co-culture trans-well 모델을 사용하여 장을 가로지르는 retinoid 수송과 장과 간세포에서의 대사를 조사했습니다. Insert에는 Caco-2 cell monolayer들이 배양되었고 apical 부분에 첨가된 compound와 basolateral 부분의 바닥에 배양된 HepaRG cell 사이에 장벽을 형성하였습니다. HepaRG cell은 Retinol Binding Protein-4 (레티놀의 생리학적 농도를 유지하고 다른 기관으로 수송하기 위해 간세포에서 분비되는 운반 단백질)의 retinol 의존성 분비를 나타내고 retinoid 치료에 대한 반응으로, retinoic-대사효소인 CYP26A1의 mRNA 발현을 상향 조절하는 것으로 나타났습니다.
Primary Hepatocyte-HepaRG™ model
HepaRG™ 세포는 다른 기관의 세포와 간 내 다른 세포의 공동 배양에 사용되는 것 외에도 1차 간세포의 수명을 늘리기 위해 공동 배양에 사용되었습니다. (Dembélé et al. al., Protocol Exchange, 2014(doi:10.1038/protex.2014.003)). 원숭이 1차 간세포의 수명은 HepaRG™ 세포와 공동 배양할 때 10-14일에서 한 달 이상으로 증가했습니다. 결과 모델은 기생충에 의한 감염을 연구하는 데 사용되었습니다.
Stellate cells-HepaRG™ model
Basu et al. (Apoptosis, 2006)은 trans-well culture format을 사용하여 HepaRG와 activated human stellate cells (HSCs)을 co-culture하여, HSC의 세포 사멸에 관련된 매커니즘을 확인하였습니다.
Stellate cell은 단독으로, 혹은 HepaRG cell을 well 바닥에 있는 HSC위의 insert에 놓거나 그 반대로 하여 culture를 진행하였고, 그 결과 immortalized human hepatocyte로부터 분비되는 soluble mediator가 HSC 성장 조절에 중요한 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었습니다.
HepaRG 문의 : 고마바이오텍(주) (02-579-8787)