재조합 단백질, 특히 단클론 항체는 이전에는 거의 치료할 수 없었던 질병에 대한 새로운 치료법을 제시함으로써 제약 시장에서 그 중요성이 높아지고 있습니다.
치료제를 위한 재조합 단백질의 생성에 사용되는 발현 숙주로 insect cell, yeast, bacteria와 같은 고전적인 숙주를 사용하거나 CHO, HEK293 cell과 같은 mammalian cell을 이용합니다. mammalian cell은 박테리아나 효모 PTM에 비해 상대적으로 human cell과 비슷한 PTM 패턴을 보여줍니다.
생물약제를 임상에 이용하기 위해서는 공정 관련 불순물이 없는 제품을 사용하여야 합니다. 세포 단백질체 (cellular proteome)는 특정 환경 조건에서 특정 세포 유형에서 발견되는 단백질의 집합체로, 단백질을 생산할때, 관심 있는 단백질 자체외에 발현 시스템 또는 기질에 존재하는 모든 단백질은 불순물로 간주되며 일반적으로 숙주세포단백질 (Host Cell Protein, HCP)라는 용어로 요약됩니다.
HCP 제거는 바이오 의약품 생산의 가장 큰 과제 중 하나입니다.
생물학적 시스템의 고유한 variability로 인해, 잔류하는 HCP의 양과 조성은 생물학적 제제 생산에 사용되는 각 숙주와 제조 공정에 따라 다르고, Host 마다 원치않는 단백질의 수가 달라집니다. 예를 들어 E.coli는 ~4300개의 유전자를 가지고 있는 반면, CHO 세포는 ~30,000개의 유전자를 갖고 있습니다. 모든 숙주 유전자가 전사되어 단백질로 translation되는 것은 아니지만, mammalian cell에 존재하는 숙주 게놈의 복잡성과 번역후 변형 (post-translational modification, PTM)은 주어진 제조 공정에서 HCP의 성분을 완벽하게 파악하기 어렵게 합니다.
공정 관련 불순물의 주요 class인 HCP는 정제된 단백질 제품에서 환자의 안전에 영향을 미칠 수 있습니다. HCP는 인체에서 생물학적으로 활성을 보일수 있고, protease 활성이 있는 HCP의 경우, 치료 단백질 자체 또는 제품 안정화 첨가제를 분해하여 제품의 안전성을 위협할 수 있습니다. 극단적인 경우, 잔류 HCP는 면역 반응 또는 anti-drug antibody를 형성하는 등의 부작용을 유발할 수도 있습니다. 따라서 규제 가이드라인은 HCP에 대한 specification을 제시하도록 의무화 하고 있습니다.
잠재적인 HCP를 검출하기 위한 방법을 개발하는 것은 최종 생물 의약품에 남아 있는 잔류 오염의 존재를 조사하기 위해 반드시 필요합니다. 다량의 단백질 내에서 소량으로 존재하는 HCP를 검출하려면 넓은 dynamic range를 갖는 매우 민감하고 구체적인 분석 방법이 필요합니다. ELISA는 일반적이면서도 사용하기에 편리하고 낮은 수준의 HCP를 정량화 할 수 있는 이점이 있습니다. HCP 추출물에 대해 최대 범위와 감도를 제공하는 맞춤형 HCP 항체의 개발이 필요합니다.
HCP Antibody와 HCP ELISA Kit
Native HCP extract에 대한 polyclonal 항체는 HCP의 식별, 검출 및 정량화에 사용하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 도구입니다. Anti-HCP 항체의 개발, 평가, 검증은 효과적인 잔류 숙주 세포 단백질 모니터링을 위해 중요합니다.
Immunoassay의 경우, 테스트에 사용되는 polyclonal antibody는 product-coding gene, fusion partner, cell line을 뺀 production cell prep으로 면역하여 생성합니다.
이후 생산 프로세스의 워크플로우를 비슷하게 모방하는 것이 중요합니다.
일반적으로 ELISA의 형태로 대부분의 HCP 불순물을 검출할 수 있으며 정량화 및 모니터링 할 수 있습니다. 그러나 일반 HCP ELISA kit는 모든 공정별 HCP를 완전히 커버하기 어려우며, 공정별로 specific한 ELISA는 공정 변경 후 HCP 함량을 평가하는 데 적합하지 않을 수 있습니다.
그럼에도 불구하고 ELISA 방법은 여전히 공정 개발 및 공정 검증에 필수 불가결합니다. 시판되는 일반 HCP ELISA kit는 임상 전 초기 단계에서 생물학적 제제의 HCP 감소를 모니터링 하는데 널리 사용됩니다. 제품 개발의 초기단계에서 사용함으로써 공정 개선 및 HCP 오염 수준을 낮추는 구체적인 데이터를 제공할 수 있습니다.
Orthogonal Methods
ELISA외에 추가 방법을 활용하는 것은 중요합니다.
MS와 결합된 2D-DIGE와 2D-HPLC와 같은 비특이적이고 orthogonal method는 더 복잡하지만 HCP profile을 전체적으로 볼수 있고 HCP 구성성분을 정성적으로 파악할 수 있습니다.
이러한 방법은 임상 개발 단계에서 제품 순도를 보장합니다.
Orthogonal method는 원료의약품 또는 완제의약품의 후속 배치에서 새로운 합성 불순물이나 분해 산물이 형성되는 경우, ELISA 방법이 특이적임을 확인하고, 지속적으로 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 특히 공정 변경 후 공정 일관성 및 제품 순도에서 ELISA를 보완합니다.
HCP Antibody & HCP ELISA Custom Production Service
단백질 의약품 공정에 맞는 HCP 항체 및 HCP ELISA kit을 제작해 드립니다.
1) Immunogen preparation :
- HMW (High molecular weight)와 LMW (Low molecular weight)를 분리하여 커버리지를 높임
2) Polyclonal Antibody production
- 70% 이상의 coverage를 달성
3) Assay condition establishment & Validation
- Sensitivity : LOD
- Specificity
- Precision experiment: Inter & Intra assay
- Stability
4) Kit production
HCP 제작 문의 : 고마바이오텍(주) (02-579-8787)
