Cytokine과 그 수용체는 염증성 및 자가면역질환, 알러지, 그리고 최근에는 암면역요법의 주요 약물 표적으로 부상했습니다. 지난 10년 동안 cytokine 기반 임상 및 전임상 개발 시험의 수가 크게 증가했습니다. 이러한 성장은 cytokine의 면역학적 기능에 대한 높은 수준의 이해와 cytokine의 anti-tumor 특성에 대한 새로운 관심, 약물공학의 개선등에 의해 이루어졌습니다.
임상 개발 중인 약물 후보를 위한 중요한 개선 사항 중 하나는 기존의 약물의 용도가 변경되어 새로운 치료법과 새로운 적응증, 새로운 표적을 위해 이용된다는 점입니다. 또한 단백질 공학에 대한 새로운 접근 방식을 통해 반감기를 증가시키고, 종양미세환경 또는 원하는 effector immune cell에 대한 cytokine 활성을 표적으로 하는 지능적으로 설계된 융합단백질을 생성했습니다. 반대로 길항 항체 (antagonistic antibody)와 small molecule, siRNA등으로 신호를 차단함으로써 cytokine의 면역 억제 역할을 검토하였습니다.
Cytokine 치료제에 Functional Cell-based Assay가 필요한 이유는?
기능적인 세포를 기반으로 한 품질관리 (QC) lot release testing은 Cytokine 치료제 개발과 특성화를 위해 매우 중요한 과정입니다. 특정 cytokine을 표적으로 하는 assay는 동일한 cytokine 작용기전(MOA)를 발현하는 세포주를 이용하여 정확하고 정밀하며 일관된 데이터를 생성해야 합니다.
Eurofins DiscoverX의 Bioassay kit는 시판되는 약물을 사용하여 검증된 bioassay를 제공하며, QC lot release test 프로그램을 위해 세심하게 제작되었습니다. GMP testing program에 적용할 수 있는 우수한 linear potency와 data quality를 제공하므로 assay 개발 및 검증 시간이 단축됩니다.
Cytokine Therapuetics 평가에 사용된 Cell-based Assay 사례
세포기반 분석을 통해 cytokine의 MOA에 따른 수용체 이량체화(dimerization)와 같은 기능적 반응을 확인할 수 있습니다. 또한 ready-to-use format의 assay로 최적화되면, 역가 및 안정성 테스트를 위한 용도로 바로 이용할 수 있습니다.
1) IL-2 Dimerization Assay
Cytokine interleukin IL-2는 주로 활성화된 T lymphocyte에 의해 생성되는 15kDa의 당단백질입니다. IL-2에 대한 수용체는 IL-2 receptor α (CD-25), β (CD-122), γ (CD-132)의 3개의 소단위로 구성됩니다.
IL-2 receptor γ 와 β chain은 수용체의 신호 전달 subunit인 중간 친화성 수용체를 형성합니다. α receptor subunit는 그 자체로 저친화성 수용체 이지만 β, γ chain과 결합하여 고친화성 IL-2 수용체를 형성합니다. 마찬가지로 IL-15 receptor는 IL-2 receptor β, γ subunit을 포함합니다. Eurofins DiscoverX의 Enzyme Fragment Complementation (EFC) based assay는 IL-2 dimerization과 IL-2 subunit의 결합을 측정하는 방법을 제시합니다.
PathHunter receptor dimerization assay의 작용원리는 다음과 같습니다.
IL-2β receptor subunit는 enzyme donor (ED)로 tagging되고, IL-2γ receptor subunit은 enzyme acceptor (EA)로 tagging됩니다. 작용제 (IL-2 혹은 IL-15)를 처리하면 2개의 receptor subnit이 이량체화되어 IL-2의 신호전달 기능을 나타내는 중간 고친화성 수용체를 형성하고, 동시에 ED 및 EA 두 단편의 융합을 유도하여 완전한 기능을 가진 β-gal enzyme을 형성합니다. 이 효소는 luminometer에서 포착할 수 있는 정량적 신호를 생성하는 chemiluminescent substrate를 가수분해 할 수 있습니다.
궁극적으로 이 분석은 IL-2 receptor dimerization의 척도로서 정량화할 수 있는 gain-of-signal sigmoidal response를 생성합니다. 이 분석 방법은 IL-2에 대한 anti-ligand molecule이나 anti-receptor molecule의 억제 반응을 정량화 할 수 있습니다.
예를들어, 항체가 IL-2 receptor를 blocking 하는 경우, 신호 반응의 손실을 정량화 가능한 inhibitiory signal로 측정할 수 있습니다.
EFC platform은 IL-2 dimerization외에도 IL-1, IL-7, IL-12, IL-15, IL-17, IL-23등 다른 cytokine의 receptor 분석에도 이용됩니다.
2) Potency testing을 위한 qualified cytokine bioassay
Qualified Bioassay는 관련 시판 의약품을 사용하여 검증된 분석법으로 우수한 linear potency를 제공합니다. 예를들어 Tocilizumab (IL-6 receptor antibody) bioassay는 IL-6에 대한 높은 정확도, 정밀도를 보여줍니다. 또한 Adalimumab, Anakinra, Sargramostim과 같은 임상 약물을 통해 각각 TNFα, IL-1, GM-CSF와 같은 cytokine target의 potency를 결정하였고, 이러한 임상약물을 통한 검증은 높은 정확도와 신뢰도를 제공하며 상대적 효능을 측정할 수 있도록 도와줍니다.
많은 human cytokine은 치료제개발에 있어 hot target으로 고려되고 있습니다.
다양한 cytokine 약물에는 변형된 작용제 (modified agonist), 공학적으로 조작되거나 변형된 cytokine drug 등이 있습니다. 다양한 cytokine target이 cytokine 치료제의 영역으로 확장되어 감에 따라 약물개발 파이프라인의 여러 단계에서 cytokine 기반 약물 개발을 가속화 할수 있는 특정 functional assay를 사용하는 것이 필수적입니다.
표적 특이적이며 검증된 bioassay를 사용함으로써 약물의 일관적인 측정 검증 및 다양한 QC lot release test를 수행할 수 있습니다.
