Antibody array와 Luminex를 이용한 줄기세포 특성화 (Characterization) 모니터링 방법 비교
R&D Systems는 줄기세포의 확장 및 분화 과정을 실시간, 비침습적(non-invasive)으로 모니터링할 수 있는 혁신적인 솔루션을 제공합니다. R&D Systems의 Proteome Profiler Antibody Array와 Luminex Multiplex Immunoassay를 활용하여, 줄기세포의 분화 및 증식 과정에서 상등액 내 분비 단백질의 프로파일 변화를 통해 줄기세포의 다능성(pluripotency) 및 분화 효율을 비침습적으로 평가할 수 있습니다.
비침습적 모니터링 방법은 크게 세 단계로 이루어집니다.
Step 1: 줄기세포를 배양합니다 (초기 줄기세포 집단 → 분화 단계 1, 2, 3 → 최종 분화 세포).
Step 2: 관심 시점(time points)에 세포 상층액 시료를 수집합니다.
Step 3: Proteome Profiler™ Array (프로테옴 프로파일러 어레이) 및 Luminex Assay (루미넥스 분석법)를 이용하여 analyte profiling을 진행합니다.
Proteome Profiler와 Luminex Multiplex assay의 차이점은 다음과 같습니다.
1. Proteome Profiler™ Array (프로테옴 프로파일러 어레이)
성격: 정성적인(Qualitative) 다분석물질 스크리닝 플랫폼입니다.
용도: 분비 단백질 프로파일(secretory profile)을 식별하기 위한 스크리닝을 시작할 때 이상적입니다.
특징:
- 세포 배양 상층액을 사용합니다.
- 동일한 세포 집단에서 시간 순서대로 시료를 채취합니다.
- 분화 과정 중 변화하는 분석물질을 식별합니다.
iPSC(유도만능줄기세포)를 간세포 유사 세포로 분화시키는 과정에서, Proteome Profiler XL Cytokine Array를 사용하여 발현에 유의미한 변화를 보이는 분석물질을 스크리닝했습니다.
Day 5와 Day 19의 어레이 이미지 비교를 통해 CXCL-1/GRO, IL-8, TFF3, RBP4, DPPIV/CD26, Chitinase 3-like 1, Angiopoietin-2, Cripto-1 등의 신호 변화를 시각적으로 보여주고 있습니다.
2. Luminex Assay (루미넥스 분석법)
성격: 정량적인(Quantitative) 다중 발현 프로파일링 플랫폼입니다.
용도: 관심 분석물질을 정의(defining)하고 정량화하는 데 이상적입니다.
특징:
- 세포 배양 상층액을 사용합니다.
- 동일한 세포 집단에서 시간 순서대로 시료를 채취합니다.
- 분화 과정 중 분석물질 변화를 정량화합니다.
iPSC를 간세포 유사 세포로 분화시키는 과정에서 감소하는 선별된 분석물질을 식별하고 정량화하는 데 Luminex Assays가 사용되었습니다. (그래프는 Angiopoietin-2, Cripto-1, Chitinase 3-like 1 등의 농도 변화를 시간 경과에 따라 보여줍니다 ).
이 실험에서 비침습적 방법(상등액 분석)을 통해 줄기세포의 다능성 및 분화 효율을 실시간으로 모니터링할 수 있음을 확인하였고, Proteome Profiler와 Luminex Assay의 조합이 줄기세포 분화 과정의 바이오마커 탐색 및 정량에 효과적임을 알수 있습니다.
FAQ
1. Proteome Profiler Array와 Luminex Assay의 차이점은 무엇인가요?
두 분석 방법의 주요 차이점은 다음과 같습니다.
즉, Proteome Profiler Array는 많은 단백질을 한 번에 스크리닝하여 변화가 있는 후보를 찾는 데 적합하고, Luminex Assay는 그 후보 단백질을 정량적으로 분석하여 세밀한 변화를 추적하는 데 적합합니다. 두 방법은 상호 보완적으로 사용될 수 있습니다.
2. Proteome Profiler Array와 Luminex Assay를 함께 사용할 때의 장점은 무엇인가요?
1) 효율적인 바이오마커 탐색 및 검증 :
Proteome Profiler Array를 먼저 사용하여 많은 단백질 중에서 변화가 있는 후보를 빠르게 스크리닝할 수 있습니다. 이후 Luminex Assay를 통해 스크리닝된 후보 단백질을 정량적으로 정확하게 분석할 수 있습니다.
2) 장비 및 비용 효율성
초기 단계에서는 특수 장비 없이 Proteome Profiler Array로 넓은 범위를 탐색하고, 필요한 경우에만 Luminex 기기를 사용하여 비용과 자원을 절약할 수 있습니다.
3) 데이터 신뢰성 향상
두 방법의 결과를 상호 검증함으로써 데이터의 신뢰도를 높일 수 있습니다.
4) 설계의 유연성
연구 목적에 따라 정성적 스크리닝과 정량적 분석을 조합하여 다양한 실험 설계가 가능합니다.
이러한 장점 덕분에 두 방법을 조합하면 줄기세포 분화 과정에서의 바이오마커 탐색과 검증이 더욱 체계적이고 신뢰성 있게 이루어질 수 있습니다.
3. Proteome Profiler Array와 Luminex Assay를 함께 사용할 때 주의할 점은 무엇인가요?
1) 샘플 일관성 유지
두 분석 모두 동일한 세포주, 동일한 배양 조건, 동일한 시간대의 상등액 샘플을 사용해야 결과 비교가 정확합니다.
2) 분석 민감도 및 범위 차이
Proteome Profiler Array는 정성적 스크리닝에 적합하고, Luminex Assay는 정량적 분석에 특화되어 있습니다. 각 방법의 민감도와 검출 가능한 단백질 범위가 다를 수 있으므로, 해석 시 이 점을 고려해야 합니다.
3) 데이터 해석의 일관성
Proteome Profiler Array에서 변화가 관찰된 단백질이 Luminex Assay에서 반드시 정량적으로 유의미한 차이를 보이지 않을 수 있습니다. 두 결과를 종합적으로 해석해야 합니다.
4) 실험 설계의 체계성
스크리닝(Proteome Profiler)과 검증(Luminex Assay) 단계가 명확히 구분되어야 하며, 각 단계별로 적절한 대조군과 반복 실험이 필요합니다.
5) 기술적 한계 인지
두 방법 모두 항체 기반 분석이므로, 항체의 특이성 및 교차반응 가능성 등 기술적 한계를 인지하고 결과를 해석해야 합니다.
4. Proteome Profiler Array와 Luminex Assay의 결과가 다를 때 어떻게 해석해야 하나요?
1) 분석 목적과 민감도 차이 인식
Proteome Profiler Array는 정성적(qualitative) 스크리닝 도구로, 변화 유무를 넓게 탐색하는 데 적합합니다. Luminex Assay는 정량적(quantitative) 분석 도구로, 특정 단백질의 농도 변화를 정확하게 측정합니다. 민감도와 검출 한계가 다르기 때문에, Array에서 관찰된 변화가 Luminex에서 미세하게 측정되지 않거나, 반대로 Luminex에서만 미세한 변화가 검출될 수 있습니다.
2) 항체 특이성 및 교차반응
두 방법 모두 항체 기반이지만, 사용되는 항체의 종류와 특이성이 다를 수 있습니다. 이로 인해 특정 단백질에 대한 검출 결과가 다를 수 있습니다.
3) 샘플 준비 및 실험 조건 확인
동일한 샘플, 동일한 조건에서 실험이 이루어졌는지 확인해야 하며, 샘플 처리 과정에서의 오차도 결과 차이의 원인이 될 수 있습니다.
4) 결과의 상호보완적 해석
두 방법의 결과를 단독으로 해석하기보다는, 스크리닝(Proteome Profiler)에서 후보를 찾고, 정량분석(Luminex)에서 그 후보의 신뢰성을 검증하는 방식으로 상호보완적으로 해석하는 것이 바람직합니다.
5) 추가 검증 필요성
결과가 불일치할 경우, 다른 분석법(예: Western blot, ELISA 등)으로 추가 검증을 실시하는 것이 신뢰도 향상에 도움이 됩니다.
5. Proteome Profiler Array와 Luminex Assay의 민감도 차이는 어느 정도인가요?
Proteome Profiler Array는 주로 정성적(qualitative) 분석에 사용되며, 단백질의 존재 유무 및 상대적 변화 탐지에 적합합니다. 민감도는 제한적이며, 낮은 농도의 단백질이나 미세한 농도 차이를 정확히 구분하기 어렵습니다. 대략적으로 pg/mL~ng/mL 수준의 검출 한계를 가집니다.
Luminex Assay는 정량적(quantitative) 분석이 가능하며, 매우 낮은 농도의 단백질도 정확하게 측정할 수 있습니다. 민감도가 높아, Proteome Profiler Array에서 탐지되지 않는 미세한 농도 변화도 검출할 수 있습니다. 일반적으로 pg/mL 수준까지 정밀하게 측정 가능합니다.
결론적으로, Luminex Assay가 Proteome Profiler Array보다 민감도가 높으며, 정량적 정확성도 뛰어납니다. Proteome Profiler Array는 넓은 범위의 단백질을 빠르게 스크리닝하는 데 적합하고, Luminex Assay는 미세한 농도 변화까지 정밀하게 분석하는 데 적합합니다.
6. Luminex Assay의 민감도가 높은 이유는 무엇인가요?
Luminex는 Assay는 서로 다른 형광 특성을 가진 미세 비드(bead)에 각각 다른 항체를 결합시켜, 한 번에 여러 단백질을 동시에 정밀하게 검출할 수 있고, 검출 항체에 결합된 형광 표지(예: phycoerythrin 등)는 매우 낮은 농도의 단백질도 민감하게 감지할 수 있도록 신호를 증폭합니다.
또한 각 비드에서 발생하는 형광 신호의 강도를 정밀하게 측정하여, 단백질의 농도를 정확하게 산출할 수 있으며, Luminex 장비는 고감도 레이저와 광검출기를 사용하여 미세한 신호도 놓치지 않고 측정하기 때문입니다.
7. Proteome Profiler Array의 이미지 해석 시 주의할 점은 무엇인가요?
- 각 점(spot) 또는 밴드의 명암(신호 강도)은 단백질의 상대적 발현량을 의미하므로, 동일한 조건에서 실험한 샘플 간 비교가 중요합니다.
- 멤브레인 전체의 배경 신호가 높거나, 비특이적 결합으로 인한 비정상적인 신호가 나타날 수 있으므로, 대조군(negative control)과 비교하여 해석해야 합니다.
- 육안 판독은 주관적일 수 있으므로, 가능하면 이미지 분석 소프트웨어를 사용해 신호 강도를 정량화하는 것이 바람직합니다.
- 여러 샘플을 비교할 때는 멤브레인 노출 시간(chemiluminescence 등)을 동일하게 유지해야 신호 강도의 비교가 정확합니다.
- 신호가 너무 강해 과포화(saturation)된 경우, 실제 단백질 농도 차이가 왜곡될 수 있으므로 적절한 노출 조건을 선택해야 합니다.
- 실험의 신뢰성을 높이기 위해 반복 실험과 적절한 대조군을 반드시 포함해야 합니다.
8. Proteome Profiler Array의 신호 강도 정량화 방법은 무엇인가요?
- 멤브레인에서 생성된 신호(점 또는 밴드)를 CCD 카메라 또는 스캐너로 촬영하여 디지털 이미지로 저장합니다.
- ImageJ, GenePix, 또는 제조사에서 제공하는 전용 소프트웨어 등 이미지 분석 프로그램을 사용합니다.
- 각 단백질에 해당하는 spot(점) 영역을 지정하고, 해당 영역의 픽셀 강도(명암값, intensity)를 측정합니다.
- 각 spot 주변의 배경 신호를 측정하여, spot 신호에서 배경 신호를 빼줍니다(Background subtraction)
- 대조군 또는 표준 샘플의 신호 강도를 기준으로, 각 샘플의 신호 강도를 상대적으로 비교합니다.
- 정량화된 신호 강도를 표, 그래프 등으로 정리하여 샘플 간 단백질 발현의 상대적 변화를 분석합니다.
[관련 제품]
문의 : 고마바이오텍(주) (02-579-8787)