EV 외부의 DNase 전처리로 EV RNA 수율 향상
소개
세포외 소포체(EV)는
기원 세포에서 유래한 microRNA(miRNA) 및 mRNA를
포함한 RNA를 포함하는 것으로 알려져 있습니다. EV RNA 연구는 EV의 세포 소스 결정, 질병 진단 및 발암성 RNA 식별과
같은 다양한 목적에 유용할 수 있습니다. EV는 직경이
~30-200nm로 매우 작기 때문에 분리 및 분석할 수 있는 RNA 화물의 양이 제한될
수 있습니다. 따라서 가능한 한 적은 수의 EV에서 RNA를 효율적으로 정제할 수 있는 강력한 방법을 갖는 것이 바람직합니다.
Biotium은 EV에서 모든 크기의 RNA를
높은 수율로 분리하기 위해 ExoBrite™ EV Total RNA Isolation Kit를 개발했습니다.
RNA 외에도 EV에도 DNA가 포함되어 있다는 보고가 있는 경우가 있습니다. 그러나 대부분의
최근 간행물에서는 EV에서 분리된 DNA가 EV 루멘 내부가 아니라 EV 외부에 있다고 제안합니다(Ref. 3). RNA 분리 키트를 개발하는 과정에서 특히 DNase 처리가
수행되지 않은 경우 세포 배양 유래 EV에서 RNA와 함께
공동 분리된 많은 양의 DNA에 놀랐습니다. 우리는 이 DNA가 EV 외부에 있는지, 그렇다면 RNA 분리 전에 EV에서 제거할 수 있는지 궁금했습니다.
당사의 EV 제제에서
분리된 DNA가 EV 외부(예: cell-free DNA)라는 가설을 테스트하기 위해, RNA 분리를
위한 EV 용해 전에 비오틴화 테트라스파닌 항체에 결합된
Biotium의 ExoBrite™ Streptavidin Magnetic Beads에서
캡처한 EV의 DNase 처리를 수행했습니다. 회수된 RNA의 수율을 DNase로
처리하지 않은 EV의 수율 및 EV 용해 후 일반적인 온-컬럼 DNase 처리를 거친 샘플과 비교했습니다. 그런 다음 Biotium의
AccuBlue® RNA Quantitation Kit 및 AccuClear® dsDNA
Quantitation Kit를 각각 사용하여 이러한 방법으로 분리된 RNA 및 DNA 양을 정량화했습니다.
EV 용해 전에 EV를 DNase로 처리하면 EV 샘플에서 거의 모든 DNA가 제거되며, 이는 일반적인 키트 프로토콜의 온-컬럼 DNase 처리와 거의 동일한 효율로 이루어집니다. 흥미롭게도, RNA 분리 절차 전에 EV DNase 처리를 수행했을 때 RNA 수율이 재현성 있게 증가한다는
것을 발견했습니다. 이러한 결과는 배양된 세포에서 유래한 EV 샘플의 DNA가 전부는 아니더라도 대부분이 EV 내에 있지 않다는 것을 시사하는데, 이는 EV 용해 전에 DNase 처리로
제거할 수 있기 때문입니다.
자료
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Amicon® Ultra-15 원심 필터 장치,
10K(Millipore Sigma UFC901096)
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qEV2 70nm SEC 컬럼(IZON IC2-70)
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ExoBrite™ EV 총 RNA 분리 키트(Biotium 28001)
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ExoBrite™ Streptavidin 마그네틱 비드(Biotium
28000)
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CD9-비오틴 항체, 비오틴-SE와 접합된 클론 HI9a(비오튬
90069)
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비오틴-SE와 접합된 CD81-비오틴
항체 클론 5A6(Biotium 90069)
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AccuClear® 초고감도 dsDNA 정량
키트(Biotium 31028)
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AccuBlue® 광범위 RNA 정량
분석 키트(Biotium 31073)
방법
EV 분리: EV는 무혈청
배지에서 3일 동안 성장한 Jurkat 또는 MCF-7 세포로부터 제조되었습니다. 세포 컨디셔닝 배지(40mL)를 채취하고 원심분리하여 세포와 파편을 제거한 다음 Amicon
Ultra 10K MWCO 한외여과 스핀 컬럼을 사용하여 상등액을 2mL로 농축했습니다. 이 농축된 컨디셔닝 배지를 IZON qEV2 크기 배제 컬럼에 로드하고 8mL PBS에 용리시켰습니다. 그런 다음 분리된 EV를 Amicon Ultra 10K MWCO 한외여과 스핀 컬럼으로 1mL로 농축했습니다. EV 농도는
ZetaView® QUATT 나노입자 추적 분석 장비에서 정량화되었습니다.
비드 내 DNase 처리: ExoBrite™ Streptavidin Magnetic Beads 프로토콜에 따라 1ug의 비오틴화된 테트라스파닌 항체(Jurkat EV의 경우 CD81-비오틴 및 MCF-7 EV의 경우 CD9-비오틴)를 250uL의
스트렙타비딘 비드에 결합하여 EV capture bead를 준비했습니다. Jurkat 세포 유래 또는 MCF-7 세포 유래 SEC 정제 EV(샘플당 3 x
1010 EV)를 포획 비드에 첨가하고 1시간 동안 회전하면서 배양했습니다. 비드를 세척하고 DNase Buffer에 재현탁시켰습니다. EV/비드 샘플은 각각 두 개의 튜브로 분할되었고, DNase I은
하나의 튜브에 추가되었습니다(그림 1). 모든 샘플을 15분 동안 배양하고 회전시킨 다음 멸균 PBS로 3회 세척했습니다.
EV에서 핵산 추출: 제품
정보 시트의 프로토콜에 따라 ExoBrite™ EV Total RNA Isolation Kit를 사용하여 3 x 10 10 EV에서 핵산을 추출했습니다. 일부 샘플은 일반적인
온-컬럼 DNase 처리가 수행되었지만 다른 샘플은 그렇지
않았습니다(그림 2). 핵산은 40 uL에서 용출되었다.
핵산 정량화: dsDNA는
어세이 웰당 10 uL의 용리액을 사용하여 AccuClear®
Ultra High Sensitivity dsDNA Quantification Kit를 사용하여 정량화했습니다. ssRNA는 AccuBlue® Broad Range RNA
Quantitation Kit를 사용하여 정량화되었으며, 어세이 웰당 10 uL의 용리액을 사용했습니다.
그림 1. EV RNA 추출을 위한 DNase 전처리 워크플로우.
그림 2. EV RNA 추출의 일반적인 워크플로우.
결과
EV RNA 추출 중 DNA를
제거하는 데 필요한 DNase I의 양을 최적화하는 한편, 온컬럼 DNase I 처리를 포함하거나 하지 않고 ExoBrite™ EV Total RNA
Isolation Kit 프로토콜을 수행했습니다. 우리는
RNA와 함께 분리된 상대적으로 많은 양의 DNA에 놀랐습니다(그림 3). 두 번의 반복 실험에서 우리는 3 x 10에서 분리된 RNA의 양이10 EV는 40ng 및 50ng에서 상당히 일정했지만 분리된 DNA의 양은 45ng 및 190ng에서 더 큰 차이를 보였습니다. 또한 DNA의 양은 우리가 예상하지 못한 RNA의 양과 같거나 더 많았습니다.
우리는 분리되는 DNA가 EV(예: cell-free DNA) 내부에 포함되어 있는 것이 아니라 EV의 외부에 있다는 가설을 세웠습니다. 이를 테스트하기 위해 비오틴화
테트라스파닌 항체(Jurkat EV의 경우 CD81-비오틴, MCF-7 EV의 경우 CD9-비오틴)를 사용하여 자기 스트렙타비딘 비드에 EV를 캡처했습니다. EV를 마그네틱 비드에 캡처하면 자기 비드가 버퍼 교환 및 세척을 위해 자석에 쉽게 고정되기 때문에 용액에서
정제된 EV보다 EV를 더 쉽게 처리하고 세척할 수 있습니다. 비드 결합 EV는 처리되지 않았거나 추출 키트에서 온-컬럼 처리를 위해 지정된 것과 동일한 완충액 및 DNase 양을 사용하여 15분 동안 DNase I로 처리되었습니다. 그런 다음 EV를 세 번 세척하고
ExoBrite™ EV Total RNA Isolation Kit의 EV 용해 버퍼로 용해시켰습니다. 온-컬럼 DNase 단계를
사용하거나 사용하지 않고 용해물에서 RNA를 분리하기 위해 키트 프로토콜을 따랐습니다.
비드 결합 EV의 DNase 전처리는 EV 유래 핵산 샘플에서 DNA를 제거하는 데 온컬럼 DNase만큼 효과적이며 DNA의 90%와 92%를
각각 제거한다는 것을 발견했습니다(그림 4, 주황색 막대). bead 및 column DNase 처리를 모두 수행한 샘플에서는
검출 가능한 DNA가 남아 있지 않았습니다(DNA 정량 분석의
검출 한계 아래에 일부 잔류 DNA가 있을 수 있음). 우리는
잔류 DNA가 EV 루멘 내부에 있는 것보다 단일 DNase 처리로 100% 효과적이지 않기 때문에 이러한 추가 효과가
더 가능성이 높다고 생각하지만 추가 테스트 없이는 이를 배제할 수 없습니다.
이 데이터를 조사하면서 흥미로운 현상을 발견했습니다: 용해 전에 EV를 외부 DNase로
처리한 두 샘플(즉, "Bead DNase" 및 "Col+bead DNase")에서 분리된 RNA의
수율은 DNanease가 없는 샘플보다 28-38% 더 높았습니다(그림 2, 파란색 막대). 이
실험은 두 개의 서로 다른 세포주(Jurkat 및 MCF-7)에서
분리된 EV로 두 번 수행되었으며, 두 경우 모두 사전 DNase 처리로 수율 개선이 관찰되었습니다.
그림 4. Jurkat에서 유래한 SEC 정제 EV(3 x 1010)를 CD81-비오틴 항체와 함께 마그네틱 스트렙타비딘 비드에 포획했습니다. EV 샘플 중 2개("Bead DNase" 및 "Col+bead DNase")는 실온에서 15분 동안 DNase I으로 처리하고, 2개의 샘플("No DNase" 및 "Column DNase")은 처리하지 않았습니다. 모든 샘플을 3회 세척한 후 용해시켰습니다. 핵산은 온-컬럼 DNase I 처리의 유무에 관계없이 분리되었습니다. 두 DNase 처리(비드 및 컬럼)는 모두 분리된 핵산에서 거의 모든 DNA를 제거했으며, 두 DNase 처리를 모두 수행했을 때 DNA를 검출할 수 없었습니다. bead-bound EV를 DNase로 처리했을 때 RNA 수율이 증가했습니다.
이것은 EV 샘플의
대부분 또는 모든 DNA가 소포 외부에 있음을 나타내는 첫 번째 보고가 아니며, 우리의 데이터는 이러한 증거를 추가합니다. 두 DNase 처리를 모두 수행했을 때 DNA의 첨가제 감소를 확인했지만, 두 번의 온-비드 또는 두 번의 온-컬럼 처리에 대해서는 대조군을 수행하지 않았습니다. 그럼에도 불구하고, 단일 DNase 처리로는 샘플의 모든 DNA를 제거하기에 충분하지 않을 수 있으며, 두 번의 순차적 DNase 처리가 더 효과적인 것으로 보입니다. 우리는 이것이 다른
응용 프로그램에서도 사실임을 확인했습니다(데이터는 표시되지 않음). 이를
명확히하기 위해 더 많은 테스트가 필요합니다.
EV 표면을 DNase 처리하여 EV 용해 전에 샘플에서 대부분의 DNA를 제거한 결과 EV 샘플의 RNA 수율이 증가했습니다(그림 1). 우리는 용해물에서
DNA와 RNA 사이의 스핀 컬럼에 대한 경쟁적 결합이 있다는 가설을 세웁니다. DNA는 RNA보다 친화도가 더 높기 때문에 친화도가 높은 실리카막에
결합하는 것으로 알려져 있으므로 이러한 경쟁은 예상치 못한 일이 아닙니다.
이러한 결과는 EV에서
고수율 및 고순도 RNA를 생성하는 한 가지 방법은 용해 및 핵산 정제 전에 EV의 DNase 처리를 수행하는 것임을 시사합니다. 그러나 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 이 절차는 현재 비드에 포획되거나
세척을 허용하는 다른 방식으로 포획된 EV에만 실용적이며, 항체와
같은 포획 분자가 샘플의 모든 EV를 포획하지 않을 수 있기 때문에 일부 EV는 손실될 가능성이 있으며 나머지 EV 모집단은 포획 분자를 기반으로
바이어스를 나타낼 수 있습니다. 그러나 보다 효율적인 EV 캡처
기술이 개발됨에 따라 이 프로세스는 광범위하게 사용할 수 있도록 더욱 실용적이 될 것입니다.
문의 : 고마바이오텍(주) (02-579-8787)