[NETRI] Chemotherapy에 의한 말초신경병증 온칩 모델: "구획화"의 강점
요약
• 독성 말초 신경병증 연구를 위한 human sensory neurons-on-chip
• 구획화 및 유체 격리를 이용한 신경독성의 작용 방식과 메커니즘 구별 : soma vs. neurites
• 치료 접근 방법 결정 : 국소 치료 방식 vs. 전신 치료 방식
• High-Throughput Assays 및 MicroElectrode Array(MEA)와 호환되는 플랫폼
개요
통증에는 여러가지 병인이 있으며 nociceptive pain (침해성 통증; 조직 손상으로 인한 통증)과 neuropathic pain (신경병성 통증; 체성감각 신경계의 손상으로 인한 통증)으로 분류할 수 있습니다. Chemotherapy로 인한 말초신경병증성 통증은 치료 과정 중 60-80%의 환자들에게 영향을 미칩니다. 20-40%의 환자에게는 치료 후에도 만성적인 통증이 지속될 수 있어 환자의 삶의 질에 큰 영향을 미칩니다.
Chemotherapy agents는 신경병증의 발병률에 따라 백금 화합물 (oxaliplatin 등), taxanes (paclitaxel 등), 면역조절제, epothilones, proteasomes 억제제, 그리고 vinca alkaloids와 같이 크게 6가지 카테고리로 나뉩니다 [1,2]. 감각 말초 신경병증의 증상에는 손과 발에서의 마비, 특히 “바늘이 박힌 듯한” 감각과 손발의 이상감각 및 저림이 있습니다. 통증을 관리하는 방법은 제한적이며 효과가 충분하지 않은데 [2,3], 이는 관련 연구 모델의 부족으로 일부 설명될 수 있습니다. 현재 동물 기반 in vivo 모델은 translationability가 부족하고 발생된 통증에 대해서만 실험할 수 있으며, in vitro assay는 작용 메커니즘과 독성을 이해하기에는 해부학적 관련성과 복잡성이 부족합니다 [4,5].
통증 신호는 주로 감각 뉴런의 자유 신경 말단에 의해 감지되고, axon을 통해 dorsal root ganglia (등근 신경절)의 세포체로 전달된 다음 dorsal horn neurons로 전달됩니다. 신경신호의 국소적인 통합과 조절은 통증을 의식하는 영역과 central modulation에 도달하기 전에 뇌가 아닌 척수 회로에 의해 수행됩니다 (그림 1).
이렇게 고도로 분리된 회로는 OoC(Organs-on-Chip) 기술로 쉽게 재현할 수 있습니다. OoC는 axon에서 뉴런 soma를 분리할 수 있는 이점을 제공하여 인간의 신경 해부학적 구조를 재현하고 실제 상황에 맞는 부상이나 치료 패러다임을 가능하게 합니다 [6].
In vivo 모델과 first-in-human studies 사이의 격차를 줄이고 관련성을 높이기 위해 인간 유도 만능 줄기세포 (hiPSC) 유래 감각 뉴런을 이용하여 통증 모델을 개발하고 관련 microfluidic 장치에 배양을 했습니다 (그림 2).
NeuroFluidics™ 라인 중에 DuaLink™를 이용하여 두가지 Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy (CIPN) 모델을 개발했습니다. 특정 작용 방식을 가진 chemotherapy agents를 탐색하고 이를 세포체 또는 원위 축삭 구획(distal axonal compartment)에 선택적으로 넣어주기 위해 DuaLink의 구획화의 강점을 이용하였습니다. 데이터는 이전 연구에서 보여준 것처럼 axonal compartment의 퇴화를 강조하기는 하지만 처음으로 high throughput 포맷으로 연구가 수행되었습니다.
그림 2. Axol Bioscience human iPSC 유래 감각 뉴런은 Axol사의 Sensory Neuron 배양 프로토콜에 따라 DuaLink Ultra™에서 21일 동안 배양되었습니다. 뉴런은 고정 후 β3-Tubulin에 대해 면역염색을 수행하였습니다. 스케일 바는 500 µm입니다.
결과
CIPN 신경병리학의 주요 특징은 원위에서 근위까지 진행되는 "dying back" axon의 퇴화입니다. 구획화된 칩 구조는 (i) distal axons를 soma와 proximal axons로부터 분리하고, (ii) 각 chemotherapy agent의 작용 방식을 각각의 세포 구획으로 분리하는 이점을 제공합니다 [8,9].
이 특징은 또한 통증 완화 분자의 작용 방식이 치료 방식과 양립할 수 있는지 여부를 결정하는 데 매우 중요합니다. 더 나아가 이 모델은 독성학적 데이터가 부족한 새로운 종류의 치료제에서 발생할 수 있는 신경병증의 잠재적 위험을 평가하는 데 사용될 수 있습니다.
Paclitaxel CIPN Model
Paclitaxel은 미세소관을 안정화시켜 축삭수송(axonal transport)을 방해합니다. 투여 방식은 soma와 mid-axons가 아닌 distal axons만 paclitaxel의 영향을 받는다는 이전 문헌 데이터를 참고하여 진행되었습니다 [8,10]. 투여량은 환자들에게서 볼 수 있는 측정된 혈장 농도 범위(80-280 nM)로 정했습니다 [11].
성숙한 hiPSC 유래 감각 뉴런은 3가지의 paclitaxel 투여량 (5 nM, 50 nM, 그리고 500 nM)을 적용하여 distal axons에서만 처리되었습니다(channel 3). 72시간 노출 후, 세포를 고정하고 신경 세포골격의 특정 마커인 β3-Tubulin을 염색했습니다. Axons에 의해 덮인 표면은 paclitaxel 투여량이 가장 많을 때 감소했고, axonal debris의 수는 증가하여 paclitaxel이 투여량에 따라 axons의 퇴화를 유도하는 것을 보여줍니다 (그림 3). High-throughput platform으로 얻은 이러한 결과는 개별 칩에 대한 이전 연구에서 10nM paclitaxel에서는 axon에 의해 덮이는 표면 영역에 영향을 미치지 않지만 50nM에서는 현저한 감소를 보여준 결과와 일관성이 있습니다 [8].
Oxaliplatin CIPN Model
Oxaliplatin은 임상에서 가장 많이 사용되는 물질 중 하나입니다. Oxaliplatin은 DNA와 결합하여 DNA 복제와 전사를 방해하는 가교(crosslinking)를 형성합니다 [12]. Oxaliplatin의 주요 표적이 핵에 있기 때문에 세가지 용량으로 (1 µM, 10 µM 그리고 100 µM) 세포체에만 적용했습니다 (channel1, 그림 4).
Paclitaxel 모델에 사용된 방법이 oxaliplatin 모델에도 적용됐습니다. 72시간 노출 후, 세포를 고정하고 신경 건강의 마커로 이용되는 β3-Tubulin에 대해 염색했습니다. 이전 in vitro 연구에 따르면 100 µM oxaliplatin에서는 axonal 수축이 관찰될 수 있는 반면 낮은 투여량에 따른 효과는 전기생리학적 기록으로만 감지될 수 있습니다 [13]. 100 µM에서 oxaliplatin은 channel3에 있는 distal axons에 의해 덮인 표면을 줄이고 axonal debris의 수를 크게 증가시킵니다. 이러한 결과를 통해 이 모델에서 oxaliplatin의 신경 독성을 확인할 수 있습니다 [2,12].
결론
위의 실험에서는 구획화된 미세 유체가 chemotherapy로 인한 신경병증성 통증의 두가지 방식을 재현할 때 사용될 수 있음을 보여주었습니다. 여기서 제시된 in vitro CIPN 모델은 다양한 응용 분야에 대한 잠재력을 가지고 있습니다.
첫째, CIPN을 예방하거나 치료하는 데 효과적인 잠재적인 약물이나 치료적 개입을 스크리닝할 때 이용할 수 있습니다. 연구자들은 다양한 화합물을 테스트하여 암 세포를 효과적으로 타겟하면서 말초 신경에는 가장 적은 신경 독성 영향을 미치는 화합물을 알아낼 수 있습니다.
둘째, CIPN의 기본이 되는 세포 및 분자 매커니즘을 이해하는 것은 표적 치료법을 개발하는 데 중요합니다. CIPN 모델은 연구자들이 통제된 환경에서 신경 세포와 chemotherapeutic agents와의 상호작용을 조절하고 관찰하는 동시에 약물의 적용 부위(axons vs. soma)를 선택하고 CIPN으로 이어지는 복잡한 세포 및 분자 상호 작용을 조사하여 연구자가 이러한 매커니즘을 분석하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 모델들은 또한 chemotherapy의 해로운 영향으로부터 신경 세포를 보호할 수 있는 잠재적인 신경 보호제를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 이는 CIPN 증상을 완화하거나 예방하는 화합물의 발견으로 이어질 수 있습니다.
동물 모델은 CIPN을 연구할 때 일반적으로 사용되지만 사람의 반응을 정확하게 복제하는 데에는 한계가 있다는 점을 명시해야 합니다. 여기서 제시된 모델은 동물 실험에 대한 보다 관련성 높은 대안을 제공함으로써 약물을 개발할 때 동물 실험의 필요성을 줄이고, 윤리적 우려, 동물 실험에 필요한 시간과 자원 등을 줄이는 데 기여할 수 있습니다.
궁극적으로 이러한 모델은 환자 유래 세포를 이용하여 만들어질 수도 있으며, 이를 통해 개인 맞춤 의학 접근이 가능해질 수 있습니다. 개개인 환자들의 세포를 이용함으로써 연구자들은 특정 환자가 특정 chemotherapy 약물에 어떻게 반응할지 평가할 수 있고, 임상의가 그에 따라 치료 계획을 조정하도록 도울 수 있습니다. 이 방법은 당뇨병성 신경병증이나 염증성 통증 등 다양한 형태의 통증을 모델링할 수 있도록 도와줄 것입니다.
