단백질 글리코실화 분석 : 재조합 Lectin을 이용한 Glycoanalysis




가장 일반적이고 복잡한 번역 후 변형(PTM) 중 하나인 당화(Glycosylation)는 분자 인식, 세포 신호 전달 및 면역 방어와 같은 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 또한, 글리코실화는 용해도, 면역원성, 순환 반감기 및 열안정성을 비롯한 당단백질의 특성에 중대한 영향을 미칩니다. 이러한 특성은 인간 치료제로서의 단백질 생산에 있어 매우 중요합니다.
글리코실화(Glycosylation)는 생물치료제 제조를 위한 QA로서 활용되며 제품 안전성과 효능을 보장하기 위해 면밀히 모니터링해야 합니다.

재조합으로 제작된 Lectin은 식물유래 Lectin에 비해 Glycan에 대한 결합력, 친화도를 높여 글리코단백질의 분석과 분리에 이상적입니다. 


Biosensor를 이용한 글리코분석 

글리코분석은 일반적으로 MS 기반 접근 방식을 사용하여 단백질의 글리코실화 profile에 대한 매우 상세한 정보를 획득합니다. 그러나 이러한 방법은 복잡하고 시간이 많이 걸리며 비용이 많이 들고 처리량 측면에서 제한이 많습니다. 

대안으로, Glycoprotein내의 glycan에 선택적인 친화성을 가진 Lectin을 Biosensor에 ligand로 이용하여 단백질 분석과 정량에 적용할 수 있습니다. 

Lectin은 주로 식물에서 분리 및 정제되어 왔는데, 식물 유래 lectin은 식물 source의 유전적 이질성에 이질성과 PTM에 의한 isotype의 혼합으로 인해 특이성이 떨어지고, 확장성과 수확량이 낮고 배치간 변화가 크고 계절에 따른 variation이 있어 제약이 많습니다. 

RPL(Recombinant prokaryotic lectin, 재조합 원핵생물 렉틴)은 이런 어려움을 극복할 수 있습니다. 단일 서열에서 Lectin이 발현되고, PTM이 없기 때문에 single specific lectin의 발현이 가능하며 scale up도 수월합니다. 재조합 발현 방식은 lectin의 결합력을 향상 시킬수 있으며, carbohydrate 인식 부위를 수정하는 등 glycan target에 대한 결합 친화도와 특이성을 높여 제작할 수 있습니다.



Scheme of lectin affinity assay performed on an Octet platform and the corresponding sensogram curves involving the most relevant assay steps: (1) Immobilisation of the biotinylated lectins on the surface of streptavidin-coated sensors, (2) binding (including association and dissociation by incubation with glycoprotein and subsequent wash with buffer) and quenching, consisting of the glycoprotein detachment by incubation with a relevant sugar solution in high concentration.
[출처 : Tailor-made  recombinant  prokaryotic  lectins  for  characterisation  of glycoproteins, Analytica Chimica Acta 1155 (2021)]


RPL을 통한 자동화된 고처리량 당분석

RPL은 BLI(Biolayer Interferometry)를 수행하는 데 사용되는 센서에 사용될 수 있으며, 이외에도 광범위한 biosensor에 고정될 수 있습니다. 예를 들어 Sartorius Octet BLI 시스템의 바이오센서에 코팅하여 샘플용액내의 항체/단백질을 반응시켰을 때, 결합이 있을 경우 optical thickness가 증가하여 파장이 변환됩니다. 이러한 방법은 처리량, 성능 및 비용의 한계를 극복하고 RPL biosensor와 결합하여 실시간으로 형광/컬러 라벨 필요없이 신속하게 단백질 분석을 수행할 수 있습니다.




당분석을 위한 RPL의 장점

lectin은 별개의 glycan을 인식하고 결합하기 때문에 당분석을 위한 강력한 도구로 이용됩니다. 재조합렉틴 (RPL)은 Plant 기반의 lectin보다 우수한 특이성과 일관성, 확장성을 제공합니다. 바이오 제조시 RPL을 사용하면 제품 개발 및 제조 능력과 효율을 향상시킬 수 있습니다.

  • 신속한 실시간, Label free 당분석
  • 모든 제품 등급과의 호환성
  • 높은 처리 용량
  • 공정분석 기술 (process analytical technology, PAT)에 응용


RPL affinity Chromatography (HPLC)

RPL은 또한 FPLC나 HPLC와 같은 chromatography resin의 ligand로도 이용될 수 있습니다.  
Affinity column에 적용하여, 복잡한 시료에서 글리칸, 당펩티드 또는 당단백질을 분리할 수 있습니다. 
재조합 Lectin 제품 문의 : 고마바이오텍(주) (02-579-8787)