도파민 뉴런의 안정적인 배양을 위한 SPOT 프로토콜
중뇌 도파민 전구 세포와 뉴런의 안정적인 생성을 위한
스포팅-기반의 배양 및 분화 프로토콜
인간 만능 줄기세포(hPSC, human Pluripotent Stem Cells)는 세포 배양을 할 때 인체의 모든 조직의 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력을 유지하고 무기한으로 자가 재생이 될 수 있기 때문에 연구와 치료 분야 모두에서 매우 큰 잠재력을 가지고 있습니다. hPSC를 원하는 세포로 분화하려면 확실하고 안정적인 프로토콜이 필요합니다. 그리고 세포 치료를 하려는 경우 프로토콜은 대규모 공급을 위해 확장될 수 있어야 하고 GMP(Good Manufacturing Practice) 표준에 적합해야 합니다.
전통적으로는 2D의 단층에서 hPSC를 배양하고 분화했습니다. 하지만, 이번에 Nature Protocol에 게재된 하버드 의대의 김지선 박사팀의 연구는 작고 한정된 영역인 스폿(spot)에서 hPSC를 배양하고 분화하는 새로운 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 28일 동안 진행되며, 연구와 치료 모두에 이상적인 중뇌 도파민 전구체(mDAPs, midbrain Dopamine Progenitors)와 중뇌 도파민 뉴런(mDANs, midbrain Dopamine Neurons)의 세포 군집을 지속적으로 풍부하게 만들어 냅니다.
이 프로토콜은 파킨슨병(PD, Parkinson Disease) 연구에서 이미 성공적으로 사용되었습니다. 파킨슨 병이란 점진적으로 근육 조절을 상실하는 질병으로, '흑색질(substantia nigra)에서의 중뇌 도파민 뉴런(mDA, midbrain Dopaminergic) 손실' 등의 병리학적 특징이 있습니다. 이런 특성으로 인해, 손실된 mDA의 세포 대체 요법을 통해 파킨슨병을 치료할 수 있는 가능성이 있습니다. 최근 연구자들은 이 스포팅 기반 프로토콜을 사용하여 mDAP를 이식한 전임상 PD 생쥐 모델에서 운동 기능이 회복된 것을 보았습니다. 뿐만 아니라 면역억제제가 필요 없는 산발성 파킨슨병 환자에게 첫 번째 자가 세포 대체 요법을 할 때 이 프로토콜을 사용하여 전구 세포를 이식하고 18-24개월이 지난 후에 환자의 상태를 확인 했을 때 파킨슨병의 증상이 안정되거나 개선되었습니다.
중뇌 도파민 뉴런(mDA) 생성할 때 2D 배양은 비효율적입니다.
기존의 연구들을 통해 우리는 Sonic Hedgehog (SHH), WNT1 LMX1A, FOXA2 및 다양한 성장 인자와 같은 주요 요소들이 생체 내(in vivo) mDAN의 배아 발달 뿐만이 아니라 시험관(in vitro)에서 hPSC에서 mDAN으로의 분화를 조절한다는 것을 알고 있습니다. 이러한 이해는 다양한 분화 프로토콜의 개발로 이어졌으며, 분화 후 도파민 뉴런 계통 유지에 소분자들이 중요하다는 것을 보여 주었습니다. 예를 들면, 변형 성장 인자 β(TGF-β, Transforming Growth Factor-β)와 뼈 형태 형성 단백질 (BMP, Bone Morphogenetic Protein) 신호는 중내배엽과 비뉴런세포와 같은 다른 계통으로 자발적으로 분화하는 것을 방지합니다.
여러 그룹의 많은 시행착오를 통해 hPSC 유형에 따라 분화에 최적화되는 성장 인자와 신호 전달 분자의 조합이 만들어졌으며, 모든 종류의 hPSC의 세포 분화를 유도할 수 있는 하나의 통일된 접근 방식은 없습니다. 예를 들어, Wnt 작용제
CHIR의 정확한 농도는 연구마다 다릅니다. 어떤 그룹은 3 μM CHIR이 mDA 뉴런 유도에 최적이라고 발견했고, 다른 그룹은 1 μM보다 낮은 농도에서도 mDA 뉴런이 생성됨을 발견했으나, 또 다른 그룹은 1.0 μM보다 높은 농도에서 후뇌 뉴런이 생성됨을 확인했습니다. GDNF,
BDNF, FGF8 과 같은 신경 영양 인자도 mDA 뉴런 분화에 중요한 역할을 하기 때문에 다른
구성 요소와 함께 최적화되어야 합니다.
마지막으로, 물리적 신호가 세포의 운명과 분화에 영향을 미치기 때문에 물리적 요인도 고려해야 합니다. 가장 중요한 물리적 요인은 물론 배양 방법입니다. 특히 3D 배양은 오가노이드의 배지 등 연구에서 많이 사용되기는 하지만, 보통은 여전히 2D 단일층 배양을 이용합니다. 2D 단일층 배양의 가장 큰 문제는 비효율성입니다. 즉, 분리, 배양 접시의 직경에 걸친 이질적인 개체군으로 인해 상당한 세포의 손실이 발생하고 종종 일관되지 않은 결과를 초래합니다.
세포 스포팅을 통해 2D 세포 배양의 단점을 극복할 수 있습니다.
FP와 NP 단계 후, 세포의 과도한 축적을 피하기 위해 15일차에 세포를 단일층 배양으로
새로 플레이팅 하고 분화를 지속하도록 했습니다. FP와 NP 단계에는 LDN, FGF8과 CHIR과 같은 신호 화학물질의 조합을 배지에 추가하고, BDNF(Brain-derived Neurotrophic Factor)와 GDNF(Glial cell line-derived neurotrophic factor)와 같은 신경 영양 인자는 mDAP/mDAN 단계에서 추가합니다.
여러 시행 착오를 통해 이러한 성장 조건을 확립했습니다. 우선, 최적의 초기 세포 밀도/농도를 탐색했습니다. 특정 농도 이하로 세포를 분주하였을 때에는 세포의 성장과 분화 특징이 좋지 않았고 수율이 낮아지고 도파민 뉴런의 건강이 좋지 않았지만, 특정 농도 이상으로 분주했을 때에는 세포는 기하급수적으로 성장하고 분리되었습니다.
여러 조건을 시도한 덕분에 다양한 인간 iPSC(induced Pluripotent Stem Cell)와 배아줄기세포(ESC, Embryonic Stem Cells) 계통에 적용되는 새로운 스포팅 기술의 보편성을 확인하게 되었습니다. 그들은 결국 0일과 28일에 주요 mDA 마커를 사용한 면역 세포 화학과 TH+, ALDH1A1+, and GIRK2+ (APC-006, Alomone Labs)의 면역 형광 공동 염색을 통해 세포의 표현형을 분류하여 확인했습니다.
배양 산성화와 같은 불리한 배양 조건으로 인해 세포 박리가 일어나 세포가 손실되는 2D 단일층 배양 방법과 달리, 3D 프로토콜은 mDA 세포를 안정적으로 생성합니다. 단일층 실험의 대략 90%는 심각한 세포 손실로 인해 28일 째에 유의한 데이터를 제공하지 못했습니다. 스포팅으로 생성된 mDA 세포는 전통적인 2D 단일층 배양 방법으로 생성된 세포보다 더 건강합니다.
유사한 밀도에서 시작하더라도, 스포팅 방식으로 배양한 세포에 비해 2D 단일층 세포는 빠르게 과밀화됩니다. 이러한 과밀화는 분리와 재성장의 주기를 만들어 세포가 성숙단계에 이르기 어렵게 할 뿐 아니라 이질적인 개체군, 배양물의 영양소 고갈, 배지의 산성화와 후속 세포의 사멸을 초래했습니다.
반면, 스포팅 방법으로 성장한 세포는 균일한 개체군을 보이며 꾸준한 성장과 분화를 보여 세포 사이에 신경돌기 같은 구조의 발달이 완료되었습니다. 그리고 스포팅 세포 배양은 더 안정적인 PH와 전반적인 화학적 환경을 유지했습니다. 그로 인해, 28일의 과정 후 배양된 세포들은 생존력이나 기능의 손실 없이 냉동 보존 및 해동될 수 있습니다.
이 프로토콜은 학계 및 산업계에서 다양하게 이용할 수 있습니다.
위에서 언급했듯이 스포팅 프로토콜은 이미 전임상 단계에서 hPSC 유래 mDA 세포를 생성하는 데 사용되었습니다. 그리고 프로토콜은 GMP 시설에서 파킨슨병 환자의 첫번째 자가 세포 이식에 대규모로 이용되었습니다. 스포팅 프로토콜은 폭넓은 잠재력이 있을 것으로 보이며, 프로토콜의 제작자들은 이 프로토콜이 다양한 곳에 적용할 수 있다고 생각합니다. 특히, 이 프로토콜을 수정하면, GABAergic 뉴런과 Glutamatergic 뉴런과 Serotonergic 뉴런과 같은 다른 신경 계통의 뉴런을 생성할 수 있다고 추측합니다.
이 기술은 모든 hPSC에 동일하게 작용하기 때문에, 모든 유형의 세포 치료, 질병 모델링 연구, 약물 스크리닝과 인간 iPSC와 ESC를 사용하는 독성 관련 연구에 유용할 것입니다. 따라서 미리 인쇄된 스포팅 플레이트가 대량 생산될 수 있다면 스포팅 기술의 상용화가 가능해질 것입니다. 특히, 이 프로토콜을 확장할 때는 배양 플레이트를 수동으로 배열해야 합니다. 제조업체가 적절하게 배열된 판을 생산할 수 있다면 프로세스를 매우 효율적으로 만들고 노력과 시간을 절약할 수 있을 것이므로 산업계에도 전망이 좋습니다.
시약
이 논문에서 사용된 Alomone Labs의 시약과 논문에서 사용된 시약을 대체할 수 있는 Alomone Labs의 제품을 소개합니다.
사용된 Alomone Labs의 항체
Anti-GIRK2 (Kir3.2) Antibody (#APC-006)
사용된 재조합 단백질의 Alomone Labs 대체품
Recombinant human BDNF protein (#B-250)
Recombinant human GDNF protein (#G-240)
References
- [사용논문] Kim, J. et al. Spotting-based differentiation of functional dopaminergic progenitors from human pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 1–25 (2022) doi:10.1038/s41596-021-00673-4.
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